PRDM1調控NF-κB信號通路對巨噬細胞極化和功能的影響①

張夢瑩 李 志 李雪琴 鐘 民 呂 坤

（皖南醫學院第一附屬醫院弋磯山醫院中心實驗室，蕪湖241001）

巨噬細胞作為一種極具可塑性和多能性的細胞群體，在免疫反應中發揮著不可替代的作用［1-3］。在機體微環境不同刺激物的影響下，可向不同類型分化且功能各異（主要分為M1型和M2型）［4-5］。B淋巴細胞誘導成熟蛋白-1（B-lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1），又稱為PR結構域蛋白1，已知它在B淋巴細胞終末分化為漿細胞并分泌大量免疫因子的過程中發揮關鍵作用，從而調控機體的免疫狀態［6-7］。并且正性調節區鋅指蛋白1（positive regulatory domain zinc finger protein 1，PRDM1）在人和小鼠的T細胞中均有表達，且高表達于CD4+和CD8+細胞系的效應及記憶細胞中［8-9］。同時PRDM1在調節T細胞的穩態上也發揮關鍵作用［10-11］。由此提示PRDM1可能與T細胞的分化和功能密切相關。因此本課題組前期實驗中通過芯片微陣列分析數據（國家生物技術信息中心數據庫登錄號：GSE81922）篩查發現，小鼠骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）體外極化過程中，PRDM1表達存在差異，與M1相比，M2中PRDM1下調表達最為明顯，提示其與巨噬細胞體外極化密切相關［12］。核轉錄因子κB（nuclear transcription faetor，NF-κB）是一種可以調控基因轉錄的核因子，被認為是巨噬細胞極化的重要調控因子，參與了TLR誘導的M1極化［13-14］。因此，本研究以巨噬細胞為研究對象，構建過表達腺病毒PRDM1，探索PRDM1是否通過調控NF-κB信號通路影響BMDMs的極化，為其在巨噬細胞極化的調控作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、2.5 g∕L胰蛋白酶（Gibco公司），高糖DMEM培養液（Hyclone公司），Trizol（美國Invitrogen公司），First-Strand cDNA Synthesis試劑盒、核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒（美國Thermo公司），PCR試劑盒（廣州銳博公司），過表達PRDM1腺病毒載體（上海漢恒生物科技有限公司），F4∕80、CD11b單克隆抗體（BD公司），PRDM1、p-IKK、IKK、p65、p-p65、β-actin、Histone單克隆抗體（Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的二抗（Biosharp公司），蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技公司），ECL發光試劑盒（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 BMDMs培養、體外誘導及鑒定 將小鼠頸椎脫位法處死，75%酒精消毒5～10 min，無菌獲取雙側股骨和脛骨，用5 ml注射器吸取L929條件培養液（含有20%胎牛血清、20% L929小鼠成纖維細胞株培養3 d的上清、100 U∕ml鏈霉素、100 U∕ml青霉素），從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到一無菌培養皿中，并將細胞充分混勻，分至6孔培養板中。在L929條件培養液中培養7 d后去除懸浮細胞，保留貼壁細胞。再加入新鮮的完全培養液RPMI1640繼續培養1 d后即為BMDMs，同時消化收集一部分細胞進行流式細胞儀檢測。第8 d后吸去上清以PBS緩沖液洗滌2遍，加入新的DMEM完全培養 液，IFN-γ（100 U∕ml）∕LPS（100 ng∕ml）或IL-4（20 ng∕ml）共同刺激培養48 h，誘導出M1∕M2型巨噬細胞。然后用Trizol裂解細胞提取總RNA，實時定量PCR檢測M1∕M2型特異性表面分子。

1.2.2 腺病毒感染巨噬細胞 將原代BMDMs在6孔板中培養1周后隨機 分 成2組：PRDM1 AdV組和陰性對照（NC）組，感染前吸出完全培養基，PBS洗滌2遍，每孔加入1 ml新鮮培養基，將10 μl PRDM1過表達腺病毒載體（1.26×1010PFU∕ml）和對照病毒載體分別滴入對應的培養孔中，輕輕混勻，感染6～8 h后更換新鮮的完全培養基，繼續于37℃、5%CO2培養箱中培養48～72 h。

1.2.3 ELISA檢測細胞培養液上清中炎癥因子的分泌 收集各組培養的細胞上清液，以1 500 r∕min離心10 min，保留細胞上清液。按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測樣品450 nm波長下測定光密度OD值，實驗重復3次。

1.2.4 巨噬細胞殺傷功能的檢測 將腺病毒感染原代BMDMs 48 h后，加入0.1×106cfu∕ml大腸桿菌（BL21DE3pLysS）至96孔板，并在37℃下孵育1 h。收集上清液，置于37℃的羅勒氏肉湯瓊脂平板上培養24 h，并計數細菌菌落。數據以cfu∕ml表示細菌菌落稀釋因子∕平板稀釋的上清液的體積。

1.2.5 巨噬細胞吞噬功能的檢測 將腺病毒感染原代BMDMs 48 h后，用PE標記的微粒（MPs）分別添加到細胞孔中（500 μg∕孔），細胞培養箱中孵育24 h。再用冷PBS洗滌2次后，從孔中收獲細胞，并用PE-Cy7標記的抗小鼠F4∕80抗體染色。最后在CytomicsTMFC500流式細胞儀（Beckman）上采集細胞。PE陽性細胞的百分比及其熒光強度使用Flow-Jo軟件進行計算。

1.2.6 總RNA提取、反轉錄及實時定量PCR收集細胞 采用Trizol提取總RNA，按反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，行熒光定量PCR檢測。引物序列見表1。實驗數據以BIO-RAD CFX Manager分析軟件進行自動分析。使用2-ΔΔCt法計算各組基因的表達水平情況。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.2.7 Western blot用4℃預冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的含蛋白酶抑制劑復合物的RIPA裂解液于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r∕min離心20 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白定量后經SDS-PAGE分離轉至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉4℃緩慢搖動孵育過夜，分別加一抗，4℃孵育過夜，經TBST洗滌3次，每次5 min；室溫用二抗（辣根過氧化物酶標記，稀釋比例為1∶2 000）孵育1～2 h，TBST沖洗，ECL顯影發光。

1.3 統計學分析 采用統計分析軟件GraphPad Prism 4.0計算各組數據的平均值和標準差，各組數據以±s表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，P＜0.05視為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 對體外極化的巨噬細胞的鑒定BMDMs體外誘導8 d后，利用流式細胞術對細胞進行鑒定（圖1A）。再分別給予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h，提取總RNA對M1、M2巨噬細胞相關標志基因進行RTqPCR檢測，結果顯示，刺激之后M1型和M2型所持有的標志基因的表達有明顯升高（圖1B，P＜0.05）。經流式細胞儀及RT-qPCR檢測，證實體外誘導的巨噬細胞極化成功。

圖1 體外極化巨噬細胞的鑒定Fig.1 Identification of polarized macrophages in vitro

2.2 PRDM1在M1和M2巨噬細胞中的相對表達水平 為了證實數據庫篩選結果，應用熒光定量PCR和Western blot檢測M1、M2中PRDM1基因和蛋白的表達情況。以M1巨噬細胞的表達為對照，結果顯示，PRDM1在M2巨噬細胞中的表達明顯低于M1巨噬細胞（圖2，P＜0.05）。

圖2 PRDM1在巨噬細胞中的表達情況Fig.2 Expression level of PRDM1 in macrophages

2.3 過表達PRDM1對巨噬細胞極化的影響BMDMs感染PRDM1過表達腺病毒載體48 h后，鏡下觀察細胞的腺病毒感染情況（圖3A）；熒光定量PCR檢測結果顯示，PRDM1過表達后BMDMs（PRDM1 AdV組）中PRDM1的mRNA表達水平較陰性對照組（NC組）顯著升高（圖3B，P＜0.001）；Western blot結果顯示，PRDM1 AdV組BMDMs中PRDM1蛋白的表達水平較陰性對照組明顯升高（圖3C、D，P＜0.05）。細胞感染腺病毒48 h后，再分別給予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h。通過熒光定量PCR檢測結果顯示，過表達PRDM1后M1型巨噬細胞表面分子iNOS、IL-12及TNF-α表達升高（圖3E，P＜0.01），而M2型巨噬細胞表面分子Arg1、YM-1及FIZZ1表達降低（圖3F，P＜0.05）。以上結果提示PRDM1可能參與調節巨噬細胞極化的過程。

圖3 過表達PRDM1對巨噬細胞極化的影響Fig.3 Effect of PRDM1 overexpression on polarization of macrophages

2.4 過表達PRDM1對巨噬細胞功能的影響 將PRDM1過表達腺病毒（PRDM1 AdV組）和陰性對照（NC組）瞬時感染BMDMs 48 h后，再分別給予IFN-γ∕LPS和IL-4刺激48 h。ELISA檢測結果顯示，較NC陰性對照組，PRDM1 AdV組M1細胞上清中TNF-α、IL-12的表達水平上調，而M2細胞上清中IL-13的表達水平下調（圖4A，P＜0.05）；細菌殺傷試驗顯示，過表達PRDM1顯著增強了BMDMs的殺菌活性（圖4B，P＜0.05）；吞噬試驗顯示，過表達PRDM1可降低BMDMs的吞噬能力（圖4C，P＜0.05）。結果表明與PRDM1過表達對M1和M2極化表型影響一致。

圖4 過表達PRDM1對巨噬細胞功能的影響Fig.4 Effect of PRDM1 overexpression on function of macrophages

2.5 過表達PRDM1促進NF-κB信號通路活化Western blot結果顯示，在M2型巨噬細胞中過表達PRDM1，NF-κB信號通路中的下游信號分子p65及IKK的磷酸化水平較NC組顯著升高。再核質分離提取細胞核蛋白，測定核內p65表達水平，結果顯示過表達PRDM1后核內p65含量較NC組顯著升高（圖5，P＜0.05）。以上數據表明，PRDM1可能通過影響NF-κB信號通路的活化參與調控巨噬細胞M1極化。

圖5 過表達PRDM1促進NF-κB信號通路活化Fig.5 Overexpression of PRDM1 promotes activation of NF-κB signaling pathway

3 討論

巨噬細胞作為機體免疫系統的重要組成部分，在慢性和急性炎癥中都能發揮重要的作用［15-16］。根據不同的刺激因素作用，可將活化的巨噬細胞分為M1和M2兩大類型，M1型巨噬細胞具有較強的促炎和抗原提呈能力，參與誘導Th1型免疫應答，直接吞噬和殺傷病原微生物，同時通過分泌促炎細胞因子和趨化因子參與炎癥反應［17］；而M2型巨噬細胞具有抑制炎癥的作用，能促進組織的修復和血管再生，并能促進腫瘤的發展，通過分泌TGF-β和IL-10等抑制性細胞因子下調免疫反應從而有效控制炎癥［18-19］。識別這兩種巨噬細胞的方式主要是通過對其特異性高表達的標志分子檢測來鑒別，iNOS、IL-12及TNF-α可用于鑒定M1型巨噬細胞，而Arg1、YM-1及FIZZ1是鑒定M2型巨噬細胞較為理想的標志分子［20］。巨噬細胞分泌適當的細胞因子和趨化因子可導致微環境的改變，以橋接固有免疫和適應性免疫反應。因此，通過調控巨噬細胞的極性達到免疫平衡將成為治療炎癥相關疾病的有效手段。

小鼠PRDM1基因全長5.1 kb，位于10號染色體，人的PRDM1基因位于6號染色體q21-q22.1位置上，全長29 kb，含有相同的結構區域。在中性粒細胞、B細胞、T細胞、巨噬細胞、上皮細胞以及肌細胞等都能檢測到PRDM1的表達［21］。KALLIES等［22］和MARTINS等［23］發現PRDM1對調節T細胞的穩態和功能具有重要作用。另外，PRDM1蛋白在CD4+和CD8+的T細胞中表達增加［24-25］。提示PRDM1對T細胞的分化有一定影響。為探究PRDM1對巨噬細胞極化的作用，本文通過過表達巨噬細胞中PRDM1發現，PRDM1不僅調節M1和M2表型標記的表達，而且還可以控制M1∕M2相關的巨噬細胞功能。過表達PRDM1能夠增加巨噬細胞中促炎因子TNF-α、IL-12的表達，并減少巨噬細胞中抗炎因子IL-13的表達；同時增強了BMDMs的殺菌活性，而降低了巨噬細胞吞噬凋亡細胞的能力。這與M1∕M2巨噬細胞典型特性相關［26-27］。上述數據表明巨噬細胞中PRDM1的過表達可以抑制M2的表型，促進巨噬細胞向M1極化。

已知NF-κB信號通路是參與炎癥反應的“明星通路”，與炎癥免疫調節反應密切相關，巨噬細胞M1極化和炎癥反應需要NF-κB的參與［28-34］。而磷酸化是NF-κB基于激活的關鍵步驟。在本研究中，通過初步觀察信號通路激活情況，發現在M2中過表達PRDM1，與陰性對照組相比，NF-κB信號通路中的下游信號分子p65、IKK的磷酸化水平明顯升高，且核內p65含量也明顯升高，提示NF-κB信號通路可能參與了PRDM1調控巨噬細胞極化和功能的過程。

綜上所述，PRDM1介導的NF-κB信號通路可能在巨噬細胞極化過程中扮演重要角色，至于PRDM1在不同巨噬細胞中差異表達的原因，還需要進一步研究。