DHRS2抑制肝細胞肝癌增殖和轉移的功能研究①

馬 軼 滕 穎 劉 慧 畢 爽（沈陽市第六人民醫院介入科，沈陽110006）

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在全球排名第六，死亡率排名第四，每年約有84萬例新發病例和78萬例死亡病例，其死亡率僅低于發病率［1］。肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發性肝癌類型，占肝癌的90%以上。盡管HCC的治療有所改善，但由于其疾病診斷時常處于晚期，導致治療具有較大局限性，HCC患者的預后和生存率仍然令人沮喪［2］。因此更徹底地了解HCC的發病分子機制，并找到更有效的治療策略至關重要。脫氫酶∕還原酶SDR家族成員2（dehydrogenase∕reductase SDR family member 2，DHRS2）也稱HEP27，最初由GABRIELLI等［3］專家從HepG2細胞系中克隆而來，并發現組蛋白脫乙酰基酶抑制劑丁酸鈉處理HepG2細胞后，DHRS2在細胞核中積累，并誘導細胞停滯在G1期。同時有研究表明，DHRS2在結直腸癌、鼻咽癌和卵巢癌等多種腫瘤中表達異常，其表達水平與腫瘤增殖、轉移和耐藥等惡性生物學行為密切相關［4-6］。但DHRS2在HCC中發揮的具體作用目前還未見報道，因此本文對此進行研究，并發現DHRS2抑制HCC細胞的增殖和轉移能力，可能是HCC新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料HCC細胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝細胞系LO2購自中國科學院；DMEM高糖培養基和FBS購于美國Hyclone公司；DHRS2過表達質粒購于上海吉凱基因公司；CCK8試劑購自美國GlpBio公司；6孔板、96孔板和Transwell小室購自美國BD公司；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白裂解液和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自中國北京索萊寶試劑公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和人髓性分化原發反應蛋白88（myeloid differentiation primary response 88，MyD88）抗體購自英國Abcam公司；ECL化學發光試劑盒購于美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 于http：∕∕ualcan.path.uab.edu∕index.html網站頁面中選擇“HCC”，并輸入“DHRS2”基因進行分析，得出TCGA數據庫中HCC組織和正常肝組織中DHRS2的表達水平。于http：∕∕kmplot.com∕analysis∕index.php？p=service網站頁面中腫瘤類型選擇“HCC”，并輸入“DHRS2”基因，點擊總生存期分析，得出kaplan meier plotter數據庫中DHRS2的表達對HCC患者預后的影響。

1.2.2 細胞培養及過表達質粒轉染HCC細胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝細胞系LO2復蘇后重懸至含10%FBS的DMEM高糖培養基，置于37℃、5%CO2全濕培養箱中培養。將呈對數生長的Huh-7細胞以2×105個∕孔接種于6孔板，分為對照組（NC組）和DHRS2過表達質粒轉染組（oe-DHRS2組），鋪板12 h，采用脂質體2000將質粒分別轉染至各組Huh-7細胞，12 h后更換新鮮培養基繼續培養。

1.2.3 CCK8實驗 取生長狀態良好的Huh-7細胞以1 500個∕孔鋪至96孔板，分為NC組和oe-DHRS2組，每組設置6個復孔，按上述過表達質粒轉染方法轉染。分別在細胞轉染后的第24 h、48 h、72 h和96 h，加入CCK8試劑，繼續孵育2 h后，酶標儀檢測各孔在波長450 nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 平板克隆實驗 取生長狀態良好的Huh-7細胞，以500個∕孔鋪至6孔板，分為NC組和oe-DHRS2組，每組設置3個復孔，按上述過表達質粒轉染方法轉染。細胞在培養箱中培養2周左右時，形成肉眼可見的克隆團。PBS洗去培養基后，加入甲醇固定，吉姆薩染色，干燥掃描后計數克隆團。

1.2.5 細胞周期實驗 取上述轉染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7細胞，加入預冷的無水乙醇固定過夜，PBS洗3次后，按照細胞周期檢測試劑盒染色，流式細胞儀分析各組細胞周期比例。

1.2.6 Transwell實驗 取上述轉染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7細胞，無血清培養基洗3次后，取1×105個細胞加入Transwell小室，下室加入500 μl完全培養基。培養24 h后，PBS洗去Transwell小室上室面細胞，甲醇固定下室面細胞，吉姆薩染色，顯微鏡下拍照，計數穿膜細胞數。

1.2.7 Western blot取上述轉染NC和oe-DHRS2 48 h的Huh-7細胞，PBS洗3次后，加入蛋白裂解液，超聲儀裂解破碎細胞，14 000 r∕min、4℃離心30 min。獲取上清液，并檢測蛋白濃度。采用10% SDSPAGE 80 V電泳分離蛋白，350 mA濕轉至PVDF膜，5%BSA室溫孵育PVDF膜1 h，TLR4和MyD88一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光條帶。Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統計學分析。數據以±s表示，t檢驗統計兩組間差異，單因素方差統計多組間的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DHRS2在HCC組織中的表達水平TCGA數據庫分析DHRS2在HCC組織中的表達水平，分析結果顯示DHRS2 mRNA在371例HCC組織中的表達低于在50例正常肝組織中的表達水平（P＜0.05），見圖1。

圖1 TCGA數據庫分析DHRS2在HCC組織中表達減少Fig.1 TCGA database analysis of reduced expression of DHRS2 in HCC tissues

2.2 DHRS2對HCC患者預后的影響Kaplan meier plotter數據庫分析DHRS2的表達對HCC患者預后的影響。結果顯示1 307例低表達DHRS2的HCC患者較3 792例高表達DHRS2的HCC患者的預后差，見圖2。

圖2 Kaplan-meier plotter數據庫分析低表達DHRS2的HCC患者預后差Fig.2 Kaplan-meier plotter database analyzed poor prog?nosis of HCC patients with low expression of DHRS2

2.3 DHRS2在HCC細胞系中的表達水平Western blot檢測DHRS2在HCC細胞系Huh-7、HepG2和SK-hep-1及正常肝細胞系LO2中的表達水平，結果顯示，DHRS2在HCC細胞中的表達均低于在正常肝細胞系LO2中的表達，在Huh-7細胞中的表達最低（P＜0.05），見圖3A。選擇Huh-7進行DHRS2過表達質粒轉染，用于后續實驗。Western blot結果顯示，DHRS2在oe-DHRS2組細胞中的表達高于在NC組細胞中的表達，DHRS2過表達質粒可顯著增加Huh-7細胞中DHRS2的表達（P＜0.05），見圖3B。

圖3 DHRS2在各細胞系中的表達Fig.3 Expressions of DHRS2 in each cell lines

2.4 CCK8檢測細胞增殖能力DHRS2過表達質粒轉染HCC細胞Huh-7后，與NC組相比，oe-DHRS2組細胞增殖能力降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 CCK8實驗檢測DHRS2抑制HCC細胞增殖能力Fig.4 CCK8 assay detected ability of DHRS2 to inhibit proliferation of HCC cells

2.5 平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力DHRS2過表達質粒轉染HCC細胞Huh-7后，NC組細胞克隆團數目為（54.65±10.15）%，oe-DHRS2組細胞克隆團數目為（18.42±3.51）%。與NC組相比，oe-DHRS2組細胞克隆形成能力降低（P＜0.05），見圖5。

2.6 流式細胞術檢測細胞周期DHRS2過表達質粒轉染HCC細胞Huh-7后，NC組G2∕M期細胞比率為（13.52±3.58）%，oe-DHRS2組G2∕M期細胞比率為（28.68±7.58）%。與NC組相比，oe-DHRS2組G2∕M期細胞比率增加（P＜0.05），見圖6。

圖6 細胞周期實驗檢測DHRS2誘導HCC細胞阻滯在G2/M期Fig.6 Cell cycle assay detected DHRS2 induction of HCC cell arrest in G2/M phase

2.7 Transwell實驗檢測細胞轉移能力DHRS2過表達質粒轉染HCC細胞Huh-7后，NC組細胞穿膜數目為（70.67±3.79）%，oe-DHRS2組細胞穿膜數目為（32.67±3.78）%。與NC組相比，oe-DHRS2組細胞轉移能力降低（P＜0.05），見圖7。

圖7 Transwell實驗檢測DHRS2抑制HCC細胞轉移能力Fig.7 Transwell assay detected ability of DHRS2 to inhibit HCC cell metastasis

2.8 Western blot檢 測TLR4∕MyD88信 號 通 路 活性DHRS2過表達質粒轉染HCC細胞Huh-7后，與NC組相比，oe-DHRS2組細胞TLR4和MyD88蛋白表達降低（P＜0.05），見圖8。

圖8 Western blot檢測DHRS2抑 制TLR4和MyD88蛋白的表達Fig.8 Western blot detected DHRS2 inhibit expressions of TLR4 and MyD88 proteins

3 討論

HCC是消化系統惡性腫瘤之一，其在亞洲發病尤為普遍，約有一半的HCC新發患者來自中國［1］。HCC的主要危險因素是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染，以及黃曲霉毒素暴露和重度飲酒等，我國乙肝患病率較高，HCC發病率具有增高趨勢［7］。目前HCC的治療主要包括手術切除、放化療和靶向治療，其中腫瘤切除和肝臟移植是早期肝癌的主要治療策略，但近40%的患者在肝切除術后的第一年內復發，且肝臟移植來源困難［8］。晚期肝癌的治療主要取決于經導管動脈化療栓塞、放療、化學療法和索拉非尼的靶向治療，腫瘤細胞對于放化療及靶向藥物的抵抗性，仍然是不可攻克的難題［9］。HCC的高度侵襲性和治療方法的局限性促使HCC長期預后仍然不能令人滿意［2］。可行且有效的治療方法是HCC的研究重點。目前HCC的發病機制尚未完全明確。因此探索HCC進展的詳細機制有助于確定HCC新的治療靶點。

短鏈醇脫氫酶∕還原酶（SDR）超家族參與多種中間代謝過程和脂質信號分子代謝，結構中含有一些常見的序列基序，如NAD∕NADP輔因子結合結構域的甘氨酸共有序列，作為催化結構域的氨基酸和分布在序列之間高度保守的氨基酸序列，這些結構使SDR酶在生理和病理過程中發揮重要功能［10］。SDR酶超家族的成員SDR25C1，又稱DHRS2，位于染色體14q11.2，該區域在許多腫瘤中具有高頻雜合性缺失，在腫瘤的發生和惡性進展中發揮重要功能［11］。DHRS2在奧沙利鉑耐藥的結直腸癌細胞HCT116中表達增加，而沉默DHRS2的表達可通過p53依賴性途徑有效地恢復奧沙利鉑的敏感性，抑制DHRS2的表達可能是預防結直腸癌奧沙利鉑耐藥的有效策略［4］。鼻咽癌中DHRS2在體內和體外抑制腫瘤細胞的生長，并可作為抗腫瘤藥物天花霉素的靶點治療鼻咽癌［5］。由此可見，DHRS2在不同類型腫瘤中發揮的作用可能不一致，而DHRS2在HCC中的具體作用未知。本文采用TCGA和Kaplan meier plotter兩大數據庫分析得出，DHRS2在HCC中表達下調，且DHRS2表達高的HCC患者具有較好的預后。與HAN等［6］報道的卵巢癌組織中DHRS2表達降低，卵巢癌患者中DHRS2的高表達與更好的預后相關結果一致。本文由于條件的限制，未在組織樣本上進行分析，但在細胞水平上檢測了DHRS2的表達，Western blot結果顯示DHRS2蛋白在HCC細胞系中的表達均低于在正常肝細胞系LO2中的表達，提示DHRS2在HCC中可能發揮抑癌基因作用。

進一步選擇HCC表達低的Huh-7細胞進行DHRS2過表達質粒轉染，研究其在HCC中發揮的具體生物學功能。ZHOU等［11］報道DHRS2表達的下調與食管癌的侵襲、淋巴結轉移、臨床分期晚期和患者預后較差有關，且體外和體內功能實驗研究均表明，DHRS2可抑制食管癌細胞增殖和細胞轉移能力。本文功能實驗結果顯示，過表達DHRS2抑制HCC細胞的增殖活性、平板克隆形成和轉移能力，并使細胞阻滯在G2∕M期，其中細胞增殖活性、平板克隆形成能力和細胞周期均反映細胞的增殖能力，表明DHRS2在HCC中與細胞增殖和轉移惡性行為有關。Toll樣受體家族是重要的受體家族，在腫瘤免疫抑制中發揮重要功能，其家族成員TLR4介導的炎癥在宿主防御入侵病原體和對炎癥刺激的生理反應中都至關重要，TLR4在慢性肝炎和肝硬化中增加，在HCC中維持高表達［12-14］。而MyD88是TLR4發揮作用的關鍵銜接分子，也是腫瘤發生過程中的關鍵分子，其調控的下游分子參與腫瘤的增殖和轉移，在HCC中MyD88呈高表達狀態，TLR4∕MyD88信號通路是促進腫瘤發生發展的重要相關途徑［15-17］。本研究發現DHRS2抑制HCC細胞中TLR4和MyD88蛋白表達，表明DHRS2可能通過降低TLR4∕MyD88信號通路活性抑制HCC細胞增殖和轉移能力。

綜上所述，DHRS2在HCC中發揮抑癌基因功能，其可能通過調控TLR4∕MyD88信號通路活性抑制HCC細胞增殖和轉移能力，DHRS2可能是治療HCC的新型有效治療靶標。