ST7L通過調控WNT/β-catenin通路抑制非小細胞肺癌惡性行為①

孫乃輝 張 亮 袁 媛 張崇光（天津市寧河區(qū)醫(yī)院普外科，天津301500）

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要因素之一，是男性中第1個最常見的惡性腫瘤，也是女性中第4大最常見癌癥［1］。在全球范圍內，肺癌的新發(fā)病例為182.5萬例，占新發(fā)癌癥病例總數(shù)的12.9%；肺癌癌癥的死亡人數(shù)為1.59萬人，占癌癥總死亡人數(shù)的19.4%［2］。在中國，每年約有73.33萬新發(fā)肺癌病例及61.22萬人因肺癌死亡［3］。其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要類型，占所有肺癌病例的85%，5年生存率非常低［4］。盡管已經開發(fā)了各種治療技術，但由于目前已知的NSCLC特異性生物標記物的種類較少，可用于臨床診斷的指標種類稀缺，可供作為抗原依賴性的免疫療法的靶標數(shù)量也較少，導致在現(xiàn)有治療標準體系下治愈率低［5］。因此，肺癌死亡率的成功降低需全面了解NSCLC的生物學過程和一些新的治療策略。

腫瘤抑癌基因7L（tumor suppressor gene 7L，ST7L），也稱為ST7R，STLR和FAM4B，位于染色體7q31區(qū)域，與同區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因ST7為同源序列，與WNT2B基因在人類染色體1p13區(qū)以尾對尾的方式聚集。ST7L在多種癌癥中表達下調，包括胃癌、神經膠質瘤、卵巢癌、肝細胞癌和甲狀腺癌［6-10］。然而，ST7L在NSCLC中的重要性及其潛在機制尚未闡明。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年11月至2017年12月天津市寧河區(qū)醫(yī)院病理科收治的25對NSCLC患者的腫瘤組織及其癌旁組織作為實驗標本，標本采集經本院倫理委員會討論通過。人NSCLC細胞系A549、H1299、H358、PC-9購自中國醫(yī)學科學院上海細胞庫；肺上皮永生化細胞系BEAS-2B購自天津ATCC分理處；ST7L的cDNA購自天津賽爾生物科技有限公司；TRIzol試劑購自Sigma公司；SYBR Green Master Mix RT-qPCR試劑盒購自南京康為試劑公司；RIPA裂解液、BCA試劑盒購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg∕ml鏈 霉 素、100 U∕ml青 霉 素 的RPMI1640培養(yǎng)基（DMED培養(yǎng)液亦可）。將上述細胞置于含CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中CO2濃度設定為5%，采用0.025%的胰蛋白酶，每隔2～3 d對細胞進行消化、傳代培養(yǎng)。

1.2.2 質粒構建 構建過表達ST7L的質粒。首先采用PCR法制備需要插入的外源片段，PCR實驗的條件為：95℃預變性3 min，（95℃變性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸2 min），共進行33個循環(huán)，72℃延伸12 min。瓊脂糖凝膠實驗回收的PCR產物大小約為1 700 bp，連接到pcDNA3載體上，獲得名稱為pcDNA3∕ST7L的過表達質粒。

1.2.3 RT-qPCR實驗TRIzol法提取NSCLC組織和肺癌細胞中的總RNA，并反轉錄為cDNA，RT-qPCR試劑盒檢測。實驗步驟如下94℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，共計35個循環(huán)。按照2-ΔΔCt法，通過β-actin對ST7L基因mRNA水平進行內源性校正，每組分別重復3次。

1.2.4 CCK8實驗 取對數(shù)生長期細胞，分別取5*103個H1299和A549細胞接種于96孔板，每孔培養(yǎng)液為100 μl，將96孔板置于含5% CO2的培養(yǎng)箱，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。待細胞貼壁后采用脂質體2000轉染上述肺癌細胞；另外，將不含細胞的完全培養(yǎng)液加入標準空白孔中對照。在不同轉染時間點結束時，將CCK8以100 μl∕孔逐一加入96孔板并繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。再采用酶標儀測定各孔吸光度（A）值，設定450 nm處波長。每組選取3個孔進行平行實驗，并重復3次。

1.2.5 細胞集落形成實驗 將實驗各組A549和H1299細胞置于6孔板中轉染，待轉染24 h后，選取0.25%的胰酶消化細胞并充分混勻，用10 μl微量移液器吸取后加入1.5 ml離心管，1 000 r∕min離心5 min后棄上清并收集細胞，收集完成后重懸細胞并計數(shù)，加入60 mm細胞培養(yǎng)皿（300個∕皿），置于CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)14 d，至肉眼可見集落時，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次。10%甲醛固定、結晶紫染色各10 min，最后用PBS洗凈后晾干并拍照，實驗累計重復3次。

1.2.6 Western blot實驗 各組已轉染細胞于48 h后，RIPA裂解液在4℃條件下裂解30 min。收集蛋白混合液至離心管，BCA試劑盒定量測定蛋白濃度。具體測定步驟如下：①在每個泳道上加注15 μg蛋白樣品；②10%SDS-PAGE電泳后將蛋白轉膜至PVDF膜，并用PBST封閉1 h；③將稀釋好的一抗分別對應加入后，置于4℃水浴箱孵育過夜；④TBST連續(xù)洗膜3次，加入二抗并置于室溫搖床內，繼續(xù)孵育2 h后重復3次TBST洗膜；⑤ECL發(fā)光試劑盒（化學發(fā)光法辣根過氧化物酶底物）發(fā)光顯影、定影及結果分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)庫分析 應用TCGA數(shù)據(jù)庫分析ST7L在正常人與腫瘤患者組織的表達水平差異；應用GEO數(shù)據(jù)庫分析ST7L在不同腫瘤分型的表達水平差異。

1.3 統(tǒng)計學分析 全部實驗過程均按標準重復執(zhí)行3次，數(shù) 據(jù) 性 實 驗 結 果 用±s表 示，采 用SPSS19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以GraphPad6.0軟件進行相關圖片制作。組間數(shù)據(jù)差異的兩兩比較采用Bonferroni法檢驗；多組間數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC中ST7L表 達 水 平 降 低ST7L的mRNA水平在腫瘤組織中降低（圖1A），且ST7L的表達水平與腫瘤的大小、TNM分期及遠端轉移呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與年齡、性別及組織學分類差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果表明，與正常組相比，ST7L mRNA水平在356例腫瘤組織中降低（圖1B），肺癌細胞系中ST7L表達水平較其永生化的正常非上皮細胞降低（圖1C），差異均有統(tǒng)計學意義。GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)ST7L的表達水平與肺鱗癌及腺癌的分型無相關性（圖1D）。

表1 NSCLC患者臨床病理資料與ST7L表達分析Tab.1 Clinical characteristics and expression of ST7L in NSCLC patients

圖1 ST7L在NSCLC中低表達Fig.1 ST7L was low expression in NSCLC

2.2 ST7L抑制A549和H1299細胞的增殖能力和周期進程，并促進細胞凋亡CCK8實驗表明，過表達ST7L后，可在24 h、48 h、72 h時間點抑制A549和H1299細胞的活性（圖2A）。集落形成實驗表明，過表達ST7L可抑制A549和H1299細胞的增殖能力（圖2B）。流式細胞術結果表明，過表達ST7L能夠抑制A549和H1299細胞 由G1期向S期 和G2期的轉換（圖2C）。凋亡實驗結果表明，過表達ST7L可促進了A549和H1299細胞的凋亡能力（圖2D）。

圖2 ST7L抑制A549和H1299細胞的增殖能力Fig.2 ST7L inhibits proliferation of A549 and H1299 cells

2.3 ST7L抑制WNT∕β-catenin信號通路的激活Western blot結果表明，過表達ST7L可抑制A549和H1299細胞中CTNNB1、C-MYC和Cyclin D1的表達水平（圖3A、B）。TOP-FOP雙熒光報告系統(tǒng)檢測結果發(fā)現(xiàn)，過表達ST7L可抑制TOP∕FOP報告載體的活性（圖3C）。免疫熒光實驗結果表明，過表達ST7L可有效 抑制A549和H1299細 胞中CTNNB1由胞漿向胞核的轉運（圖3D）。

圖3 ST7L失活WNT/β-catenin信號通路Fig.3 ST7L inactivated WNT/β-catenin signaling path?way

3 討論

ST7L作為抑癌基因在腫瘤中的作用已被報道。例如，過表達ST7L可抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移侵襲能力［8］；ST7L在膠質瘤中抑制細胞的惡性行為，但其在NSCLC中的研究報道較少［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達ST7L后能顯著抑制A549和H1299細胞的增殖能力和細胞周期進程，并促進細胞凋亡。

ST7L是ST7的同源基因，含有575個氨基酸，最早由KATOH等［11］借助cDNA-PCR和生物信息學預測手段確定。由于染色體區(qū)域的重組或等位基因的缺失，ST7L也可能發(fā)揮抑癌基因作用，并與miRNA的調控密切相關。近期研究表明，其在乳腺癌、宮頸癌、肝細胞癌、胰腺癌等的侵襲與轉移中也發(fā)揮非常重要的調控作用［12-15］。

WNT信號通路是進化上高度保守的通路之一，通過膜受體蛋白與配體蛋白WNT結合，將胞外信號傳遞到胞內，負責調控機體胚胎發(fā)育、細胞命運及正常組織的均質穩(wěn)定等關鍵的生物過程［16-17］。WNT途徑的主要組分如下：WNT配體、卷曲蛋白受體、LRP5∕6共受體（低密度脂蛋白受體相關蛋白5∕6）、Dsh（Dishevelled）、β-連環(huán)蛋白和TCF∕LEF（T-細胞因子∕淋巴增強因子）及由APC（腺瘤性結腸息肉）、軸蛋白（腳手架蛋白）和兩種激酶CK1α（酪蛋白激酶1α）和GSK-3β（糖原合酶激酶3β）組成的一種“降解復合物”［18］。WNT配體和β-連環(huán)蛋白在該途徑中發(fā)揮關鍵作用［19］。當WNT信號通路被激活時，β連環(huán)蛋白被導入細胞核，其可與TCF∕LEF家族的轉錄因子相互作用，招募轉錄共激活p300和∕或CBP（CREB結合蛋白）以及其他組件子轉錄下游目標基因云，包括c-MYC的和細胞周期蛋白D1等［20］。

本篇研究構建了pcDNA3∕ST7L的過表達質粒，提取NSCLC組織和肺癌細胞中的總RNA并反轉錄為cDNA，通過CCK8、集落形成實驗、細胞周期試驗檢測出ST7L在A549和H1299細胞中可通過抑制WNT信號的活化影響C-MYC和Cyclin D1的表達水平，從而有效抑制細胞增殖和周期進程并促進細胞凋亡?；赥CGA和GEO臨床數(shù)據(jù)庫，正常組織表達結果與NSCLC癌組織檢測結果對照分析，也顯示NSCLC中ST7L表達水平降低。

綜上，課題組在NSCLC細胞中確定ST7L作為抑癌基因通過抑制WNT信號通路的活化，抑制A549和H1299細胞的增殖能力和細胞的周期進程，可能為臨床診斷和精準治療NSCLC提供了分子基礎和新的策略。