民族藥翠綠針毛蕨質量標準的研究

魏安華，阮金蘭，周道年

1.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院藥學部，湖北 武漢 430033；2.華中科技大學同濟醫學院藥學院，湖北 武漢 430030；3.馬應龍藥業集團股份有限公司，湖北 武漢 430064

翠綠針毛蕨（Macrothelypteris viridifrons）是土家族常用的藥用蕨類植物，屬于金星蕨科（Thelypteridaceae）針毛蕨屬（Macrothelypteris）植物的一個亞種，廣泛分布于長江以南各省，西至四川，南至云南東北部，從海拔起到海拔1 000 m 處均可生存，且在亞洲、澳大利亞、美洲熱帶及亞熱帶地區都有分布［1］。翠綠針毛蕨具有清熱解毒、利尿、止血等功效，民間常用于治療咽喉腫痛、出血、腫瘤等疾病［2］。雖然我國南方少數民族地區應用翠綠針毛蕨的歷史很久，但由于國內對于蕨類植物的關注度普遍不高，其系統的研究報道相對較少，筆者所在課題組長期以來一直專注于國內藥用蕨類植物的研究開發，經前期大量篩選研究發現翠綠針毛蕨是具有顯著抗腫瘤藥理活性的蕨類［3-4］。本研究以江西九江藥材為基礎，原芹菜素為對照，從藥材性狀、鑒別及含量等方面進行系統研究，為該藥材的質量標準規范提供參考。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀：HITACHI L-2130；記錄儀：T2000P；檢測器：HITACHI UV Detector L-2400。電子分析天平：上海梅特勒-托利多公司。超聲清洗機：上海冠特超聲儀器有限公司。硅膠G 預制薄層板（青島海洋化工有限公司，批號：20160403）。藥材采自江西九江，經九江森林植物標本館館長譚策銘鑒定為翠綠針毛蕨Macrothelypteris viridifrons的根莖；原芹菜素對照品（純度＞98%）：自備。HPLC 級甲醇：天津科密歐化學試劑公司。水為超純水。其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 性狀

本品呈不規則圓形或扁圓形，短而直立，先端表面紅棕色，密被具毛的披針形鱗片，并有彎曲棕色須根。質硬而脆，斷面呈不規則棕色，有環列的黃白色維管束。

2.2 顯微特征鑒別

本品根莖橫切面呈黃白至棕色，可見斷續環狀排列的黃白色維管束；皮層及髓均由薄壁細胞組成，細胞中含淀粉粒及棕色物；表皮細胞一列，殘存棕黃色非腺毛，其內有十余列棕黃色厚壁細胞。本品粉末深黃色至棕色，纖維細長，成束或單個散在；維管束環狀排列；可見明顯管胞和腺毛；管胞大多為梯紋，長達20～100 μm，狹長形，兩端尖斜，管胞之間的紋孔大小不一；薄壁細胞呈長方形或圓形。淀粉粒多數，單粒或復粒，直徑1～2 μm，臍點和層紋明顯。其中管胞，厚壁細胞，薄壁細胞，纖維，非腺毛，內含物等特征見圖1。

圖1 翠綠針毛蕨藥材粉末特征圖

2.3 薄層色譜鑒別

取對照品原芹菜素，加甲醇溶解制成1.0 mg/mL的對照品溶液；另取翠綠針毛蕨藥材粉末約1.0 g，加入20 mL 甲醇，于80 ℃下回流提取60 min，過濾后，將濾液濃縮至5 mL 作為供試品溶液；再取翠綠針毛蕨對照藥材，同法制成對照藥材溶液；按照薄層色譜法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗［5］，吸取供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液各4 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-甲醇=15∶1 為展開劑進行展開，取出晾干后噴以10%硫酸-乙醇溶液，于120 ℃下烘至斑點顯色清晰，樣本色譜中供試品溶液在與對照品色譜相應的位置上，顯現相同斑點，原芹菜素呈現黃色斑點，Rf 值為0.3，結果見圖2。

圖2 翠綠針毛蕨藥材薄層鑒別圖譜（1.原芹菜素對照品；2.翠綠針毛蕨藥材；3.對照藥材）

2.4 檢查

2.4.1 水分 按照水分測定法（《中國藥典》2015 年四部通則0832 第二法）烘干法［5］，測定本品藥材10 批，結果規定藥材水分不得超過11.1 %。

2.4.2 總灰分和酸不溶性灰分 按照灰分測定法（《中國藥典》2015 年四部通則2302）項下的總灰分和酸不溶性灰分測定方法［5］，測定本品藥材10 批，結果規定總灰分不得過4.0%，酸不溶性灰分不得過2.0%。

2.5 浸出物

按照浸出物測定法（《中國藥典》2015 年四部通則2201）項下的浸出物測定方法［5］，以乙醇為溶劑，采用熱浸法，測定本品藥材10 批，結果規定浸出物不得少于14.5%。

表1 水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測定結果（%）

2.6 HPLC 含量測定

原芹菜素（結構式見圖3）為本品主要化學成分，因此本文通過建立HPLC 測定原芹菜素含量的方法來對翠綠針毛蕨藥材進行質量控制。

圖3 原芹菜素結構式

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Amethyst C18-P（250 mm× 4.6 mm，5 μm），柱前加保護柱；柱溫：25 ℃；檢測波長：262 nm；以甲醇的水溶液作為流動相，梯度洗脫程序為0 min（30∶70）-40 min（100∶0）；流速：1.0 mL/min。

2.6.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品原芹菜素5.2 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為原芹菜素的標準儲備溶液，濃度為0.520 mg/mL，對照品溶液的色譜分離結果見圖5（A）。

2.6.3 供試品溶液的制備 精密稱取約1.0 g 干燥至恒重的翠綠針毛蕨根莖藥材粉末，置50 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL 甲醇，80 ℃下回流提取60 min，放冷至室溫，甲醇補足失重，搖勻，濾過，濾渣再加入20 mL 甲醇，再回流提取1 次，過濾，合并兩次濾液，濾液定容至100 mL 容量瓶，搖勻，即得供試品溶液。進樣前用0.45 μm 微孔濾膜過濾。

2.6.4 系統適用性試驗 精密吸取供試品和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，按“2.6.1”色譜條件測定，記錄色譜圖。樣品中原芹菜素與其他組分的色譜峰分離度大于 1.5，色譜峰理論板數≥3 000，峰形對稱，具體色譜分離結果見圖4。

圖4 翠綠針毛蕨高效液相色譜圖

2.6.5 線性關系考察 采用逐級稀釋法，將對照品母液分別稀釋至濃度為520.00、260.00、130.00、65.00、32.50、16.25 μg/mL的對照品溶液，以20 μL 注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，并以進樣濃度對峰面積進行回歸處理，得到回歸方程y=30 277x+202 335（R2=0.999 8），結果表明原芹菜素進樣濃度在16.25～520.00 μg/mL 范圍內，呈良好的線性關系。

2.6.6 重復性試驗 精密稱取藥材（編號：M-1）粉末約1.0 g，共6 份，分別置50 mL 圓底燒瓶中，按“2.6.3”項下供試品溶液制備方法和“2.6.1”項下色譜條件進行分析，結果原芹菜素平均含量10.66 mg/g，RSD為2.0%。

2.6.7 穩定性試驗 精密稱取藥材粉末約1.0 g，置50 mL 圓底燒瓶中，按“2.6.3”項下供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，精密吸取20 μL，于配制后0、3、6、12、24 h 測定峰面積以考察供試品溶液的穩定性，共考察了24 h，結果表明供試品在24 h 內具有較好的穩定性，RSD 為0.67%。

2.6.8 回收率試驗 分別精密稱取藥材粉末約1.0 g，共6 份，分別加入一定量的原芹菜素標準品，按“2.6.3”項下供試品溶液制備方法和“2.6.1”項下色譜條件進行分析，結果原芹菜素加樣回收率為98.9%，RSD=1.9%。

2.6.9 藥材含量測定 分別精密稱取6 批次的藥材粉末各1.0 g，置50 mL 圓底燒瓶中，按“2.6.3”項下供試品溶液制備方法和“2.6.1”項下色譜條件進行分析，各批次藥材中原芹菜素的含量見表2，原芹菜素含量范圍為10.55～11.13 mg/g。

表2 原芹菜素含量測定結果（n=3）

3 討論

翠綠針毛蕨主要產自亞洲熱帶和亞熱帶、大洋洲東北部和太平洋島嶼等地方，我國已有7 種1 變種，分布于長江流域以南各省區［1-2］。目前針毛蕨屬植物相關化學成分及生物活性研究不多見，作為國內藥用蕨類植物的主要研究團體，我們長期以來一直專注于國內藥用蕨類植物的開發研究，翠綠針毛蕨是我們前期經過大量篩選研究發現的具有顯著抗腫瘤藥理活性的蕨類，體外研究表明翠綠針毛蕨具有顯著的抗腫瘤活性和廣泛的抗瘤譜［3］。體內試驗也顯示翠綠針毛蕨提取物對小鼠肝癌和結腸癌均具有很好抑制作用，以翠綠針毛蕨醇提取物250 mg/kg 灌胃H22 肝癌模型小鼠和C26 結腸癌模型小鼠10 d，腫瘤生長抑制率分別為58.9%和68%，與陽性對照環磷酰胺的效果接近［4］。令人驚喜的是，研究發現翠綠針毛蕨對正常細胞毒性較小，無明顯免疫抑制，無血液和肝、腎毒性，具有良好的安全性。從已有化學成分研究來看，翠綠針毛蕨的主要成分是黃酮類化合物，特別是含有B 環非苯環結構的黃酮，即色原酮環己烯酮系列衍生物，該類化合物結構新穎罕見，其抗腫瘤療效及作用機制已成為學者研究熱點［3-4,6-7］。

本試驗按照規范的中藥材質量標準制定方法建立了翠綠針毛蕨根莖的質量標準［8-9］。其中，通過對翠綠針毛蕨性狀和顯微特征的描述，以及薄層鑒別中，清晰出現的原芹菜素斑點，能較好地將它與同屬其他植物相區分；由檢查可知，翠綠針毛蕨藥材各指標的控制范圍分別為：浸出物含量不低于14.5%，總灰分不得超過4.0%，酸不溶性灰分不得超過2.0%，水分量應低于11.1%。

根據課題組前期研究結果［3,10］，黃酮類成分可能是翠綠針毛蕨的主要活性成分。目前黃酮含量測定方法有紫外分光光度法、HPLC、薄層掃描法以及毛細管電泳法等［11］。本研究建立了HPLC-UV 方法來測定翠綠針毛蕨藥材中的原芹菜素，方法簡便、快速、可靠。實驗中通過紫外的全波長掃描，發現原芹菜素在262 nm 附近具有較大的吸收度且溶劑干擾少，基線平穩，故檢測波長設定為262 nm；通過藥材提取方法和提取時間的考察，即不同時間的超聲波提取和回流提取，結果顯示回流提取60 min 是最優的含量測定提取條件；最后通過流動相的考察確定了色譜分離條件，結果表明：當采用不同比例的流動相等度洗脫時無法實現原芹菜素峰與其他物質的分離，而采用甲醇水溶液的梯度洗脫則具有很好的分離效果，分離度大于1.5，理論板數按原芹菜素峰計算，不低于3 000，完全符合《中國藥典》的要求。在優化的條件下，能夠在40 min 之內測定翠綠針毛蕨藥材中原芹菜素，適用于翠綠針毛蕨藥材的質量控制。

4 結論

建立民族藥質量標準的研究，是安全、有效、合理開發應用民族藥的基本保證。本文通過考察試驗條件，對翠綠針毛蕨藥材的形狀、顯微、薄層色譜進行研究，同時采用HPLC 法測定原芹菜素含量，簡便可靠，分離度高，重現性好。本文建立的方法可用于翠綠針毛蕨的質量控制，可為進一步探討其抗腫瘤藥效學物質基礎和更好的開發利用奠定物質基礎。