基于IL-6/STAT3 信號通路探討糞菌移植干預濕熱蘊結型腸癌小鼠的作用機制

吳成成，黃海鵬，羅文兵

1.江西中醫藥大學附屬醫院，江西 南昌 330006；2.新余市中醫院，江西 新余 338000；3.分宜縣中醫院，江西 分宜 336600

腸癌在我國乃至全世界的發生率都比較高，尤其是近些年，其發病率逐年攀升［1-2］。通常腸癌患者的治療都依靠手術、藥物、化療等方式，然而患者生存率依舊不容樂觀［3-4］。在腸癌的患者中，濕熱蘊結型占了很大一部分［5］。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是一種新型的治療腸道疾病的方法，主要通過重新構建腸道微生態，增強機體代謝和免疫來發揮作用［6］。IL-6/STAT3 信號通路通常被認為與各類腫瘤的發展密不可分［7］。FMT 用于治療濕熱蘊結型腸癌并且與IL-6/STAT3信號通路的關系還尚不清楚。因此，本文主要研究FMT 對濕熱蘊結型腸癌小鼠IL-6/STATE3 信號通路的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級km 小鼠30 只，6 周齡，體質量20～25 g，雌雄各半，購自武漢萬千佳興生物科技有限公司。

1.2 糞菌制備

收集由捐獻者提供的50 g 新鮮糞便，用3～5 倍體積的無菌生理鹽水稀釋，用攪拌器攪拌后立即放入GenFMTer 智能糞菌分離儀（南京法邁特科技發展有限公司）處理，按說明書操作，全過程在一次性密閉管路中完成，獲取糞菌懸液1 h 內進行糞菌懸液灌注。

1.3 實驗方法

將小鼠按隨機數字表法分為模型組和FMT 組以及對照組。模型組和FMT 組建立濕熱蘊結型腸癌小鼠模型，步驟：高糖高脂飼料喂養10 d，然后將小鼠置于高溫倉（溫度35 ℃，相對濕度85%），每天持續8 h，連續3 d 后以產毒性大腸桿菌（109/mL）灌胃（2 mL/只），24 h 后再灌胃1 次，最后為每只小鼠接種含2×107個/mL 人結腸癌HCT116 細胞和20 μg 微載體的復合物懸液100 μL。對照組正常自由飲食并給予等量生理鹽水。造模后，FMT 組每日給予15 g/kg 糞菌劑量灌腸處理，灌腸體積0.2 mL。對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌腸處理。1周后脫頸椎處死，取出肛緣至回盲部的結直腸做后續檢測實驗。

1.4 腫瘤體積、腫瘤質量的計算

取小鼠腫瘤組織，測量其長短徑，稱取其質量，計算腫瘤體積和抑瘤率。腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2。

1.5 觀察指標

（1）各組小鼠腫瘤體積以及腫瘤質量。（2）采用免疫組織化學法檢測各組小鼠直腸組織Ki-67 的表達。（3）采用ELISA 法和Western Blot 分別檢測各組小鼠直腸組織IL-6/STAT3 信號通路活化情況。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 腫瘤體積以及腫瘤質量

與模型組比較，FMT 組腫瘤體積以及腫瘤質量均小于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠腫瘤體積與腫瘤質量比較（）

表1 小鼠腫瘤體積與腫瘤質量比較（）

2.2 Ki-67 以及IL-6 的表達

與對照組比較，模型組小鼠Ki-67 以及IL-6的表達均上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，FMT 組Ki-67 以及IL-6 的表達均下調，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 小鼠直腸組織Ki-67以及IL-6的表達

2.3 各組小鼠直腸組織STAT3、p-STAT3 表達

與對照組比較，模型組小鼠STAT3、p-STAT3表達均上調，差異有統計學意義（P＜0.05），與模型組比較，FMT 組小鼠STAT3、p-STAT3 均下調，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3，圖1。

表3 小鼠直腸組織STAT3、p-STAT3表達

圖1 小鼠直腸組織STAT3、p-STAT3表達

3 討論

近些年來，許多腫瘤標志物被用來對疾病的發展以及預后進行監測，Ki-67 是一種與細胞增殖相關的細胞核抗原，它的表達水平反映了細胞增殖水平的高低，通常在正常細胞中其表達很低甚至沒有表達，而在腫瘤細胞中表達卻很高［8-9］。臨床研究也顯示［10-11］，腸癌組織中的Ki-67 呈現高表達，而在癌旁組織中表達明顯較低。因此，本研究挑選其作為細胞增殖標志物用于直腸癌的研究。本研究中，模型組小鼠直腸組織中Ki-67 的表達明顯比對照組高，表明腸癌模型建立成功。

研究顯示［12］，IL-6/STAT3 信號通路與細胞的增殖、分化有關，并且參與到各種實體瘤的發展當中，其作用過程主要是通過IL-6 與其作用靶點結合使蛋白酪氨酸激酶（JAK）二聚體化，進一步促使STAT3 被激活，而STAT3 的異常活化能夠加速癌癥細胞的增殖，使腫瘤組織不斷增大，對癌癥的發展具有明顯的促進作用。除此之外，IL-6/STAT3通路的高表達可促進耐藥蛋白及抗凋亡蛋白表達。本實驗同樣發現，在濕熱蘊結型腸癌小鼠的直腸組織中IL-6/STAT3 通路被異常激活，腫瘤生長迅速，說明IL-6/STAT3 通路與濕熱蘊結型腸癌的發展密不可分。

中醫指出，大部分腸癌患者通常都會脾虛，脾氣的缺失會導致濕氣聚集，形成濕毒堆積在腸道內，對患者恢復產生極大阻礙。此外，濕毒在腸癌發展當中會破壞腸道微環境，導致機體腸道環境的紊亂。一般情況下，雙歧桿菌屬、乳酸菌屬等益生菌存在于腸道內，它們能在腸道黏膜上建造起一座生物屏障抵御外來侵害，而腸桿菌屬、腸球屬是腸道中的正常棲息菌，當腸道平衡被打破，這些正常棲息菌數量會劇增并對腸道生物屏障造成損害，使腸道抵御外來侵害能力變弱，不利于腸癌患者的治療。FMT 是將含有正常菌種的糞便灌注到患者腸道里從而起到修復腸道環境的一種治療方式。主要通過修復腸道內環境穩態來發揮其對各種腸道疾病的治療作用。本研究發現，在使用FMT 治療后，小鼠的腫瘤體積以及腫瘤質量有了一定程度的下降，說明FMT 對濕熱蘊結型腸癌小鼠有一定的療效，進一步檢測腫瘤細胞的增殖以及IL-6/STAT3 通路的激活情況時發現，腫瘤細胞的增殖以及IL-6/STAT3 通路的活化都明顯受到了抑制。

綜上所述，FMT 對濕熱蘊結型腸癌存在一定的治療效果，其機制可能是通過抑制IL-6/STAT3 通路的激活，進一步降低Ki-67 的表達，從而抑制腫瘤細胞的增長。