HPLC法測定復(fù)方大紅袍止血膠囊中沒食子酸的含量

覃媛媛，沈嘉華

（楚雄州食品藥品檢驗所，云南 楚雄 675000）

復(fù)方大紅袍止血膠囊（compound dahongpao zhixue capsules）為云南龍發(fā)制藥股份有限公司獨家品種，是由大紅袍、柿蒂兩味中藥材經(jīng)提取制成的彝藥制劑，功效為收斂止血，用于功能性子宮出血、人工流產(chǎn)術(shù)后出血、放取環(huán)術(shù)后出血、鼻衄、胃出血及內(nèi)痔出血等（彝醫(yī)功能主治稱為差嫫且凱斯多，斯開色土，卑開塞嘟）。復(fù)方大紅袍止血膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為局頒標(biāo)準(zhǔn)（國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)WS-10364-2002-2011Z），制定有大紅袍的薄層鑒別和鞣質(zhì)的容量法含量測定。本研究中通過高效液相色譜法（HPLC）對大紅袍和柿蒂中均含有的沒食子酸進行含量測定，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供重現(xiàn)性好、專屬性強的檢驗方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司；檢測器：DAD）；賽多利斯BT125D（0.01 mg）電子分析天平（德國賽多利斯公司）；梅特勒MS304 TS/02（0.1 mg）電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ELGA 超純水機（法國威立雅公司）。

1.2 試藥 沒食子酸對照品（批號111703-201504，含量90.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；復(fù)方大紅袍止血膠囊（云南龍發(fā)制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號分別為 171104、180105、180509、180908、181001、190102、190103、190104、190105、190106）；陰性對照樣品由云南龍發(fā)制藥股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（5∶95）；檢測波長272 nm；流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μl；理論板數(shù)以沒食子酸峰計算應(yīng)不低于7000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取沒食子酸對照品10.09 mg置100 ml 量瓶中，加5%鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，精密量取5 ml 置50 ml 量瓶中，加5%鹽酸溶液稀釋至刻度，即得沒食子酸質(zhì)量濃度為9.1617 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入5%鹽酸溶液50.00 ml，稱定重量，置水浴中回流水解4 h，放冷，用5%鹽酸溶液補足減失的重置，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 取不含大紅袍藥材、不含柿蒂藥材、不含大紅袍和柿蒂藥材的陰性樣品，按照“2.2.2”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品在與沒食子酸對照品主峰保留時間相應(yīng)的位置上有相同色譜峰出現(xiàn)，且主峰與相鄰色譜峰能完全分離，峰形良好，理論板數(shù)能達到7000，陰性樣品無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

圖1（續(xù)）

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液2、4、8、10、20、30 μl，注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進樣量為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得沒食子酸的回歸方程（n=6）為：Y=3150X-1.789，r2=1.0000，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒食子酸在1.832～27.485 μg/ml 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μl，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6 次，平均峰面積為285.55496，RSD 為0.06%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號：190101）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件測定，平均含量為0.5963 mg/g，RSD 為1.86%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取對照品溶液和同一批樣品（批號：190101）供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、16、12、32、48 h 進行測定，記錄色譜圖，對照品溶液和供試品溶液沒食子酸峰面積RSD 分別為0.38%和1.21%，結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率實驗 稱取已知含量的復(fù)方大紅袍止血膠囊（批號：190101）內(nèi)容物6 份，0.5 g/份，精密加入相當(dāng)于樣品中所含沒食子酸量100%的對照品儲備液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果（n=6）

2.9 樣品含量測定 取樣品10 批，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算10 批樣品中沒食子酸含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/粒）

3 討論

3.1 HPLC 成分確定 《中國藥典》2015 年版一部[1]“柿蒂”薄層鑒別項下以沒食子酸為對照品，國內(nèi)外亦有文獻報道柿蒂中含有沒食子酸[2，3]，雖未查詢到文獻表明大紅袍含有沒食子酸，但通過對原藥材的檢測表明其含有該成分。沒食子酸具有較強的抗炎抗氧化作用，能抑制腫瘤形成，同時能通過抑制內(nèi)皮NO 的生成降低血管松弛，從而起到止血作用[4，5]，故本研究將沒食子酸選定為含量測定目標(biāo)成分。

3.2 檢測波長的選擇 本文研究對沒食子酸進行全波段掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在215 nm 和272 nm 波長處均有吸收，結(jié)合紫外響應(yīng)值大小、色譜峰峰形對稱尖銳、陰性無干擾等條件，選擇272 nm 作為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 本研究觀察了乙腈-水、乙腈-不同濃度磷酸溶液、甲醇-水、甲醇-不同濃度磷酸溶液等多種不同配比流動相對組分分離、保留時間的影響，結(jié)果表明甲醇-水（5∶95）為最佳流動相，能使被測成分與其它成分較好的分離，峰形好，陰性對照無干擾。

3.4 提取方法的選擇 參考《中國藥典》2015 年版一部[1]中“五倍子”“地榆”“余甘子”“腸炎寧片”“宮炎平片”含量測定項下供試品溶液制備方法，考察了不同溶劑（4 mol/L 鹽酸溶液、5%鹽酸溶液、50%甲醇、甲醇），不同提取方法（超聲、加熱回流），不同提取時間（3、4、5 h）的提取效果，最終確定5%鹽酸溶液加熱回流4 h 為最佳提取方法。

3.5 耐用性考察 本研究對不同廠家、型號色譜柱（色譜柱A：Agilent SB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；色譜柱B：Agilent 5 HC-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；色譜柱C：Thermo AcclaimTM 120-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm 和色譜柱D：Shiseido CAPCELL PAK MGⅡ-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm），不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃），不同流速（0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min）進行了耐用性考察，結(jié)果表明文中確定的色譜條件對色譜峰峰形、分離度、理論塔板數(shù)影響性不大，耐用性較好。

綜上所述，復(fù)方大紅袍止血膠囊是一個療效確切、使用廣泛的彝藥制劑，其檢驗標(biāo)準(zhǔn)最早收載于《國家藥品中藥標(biāo)準(zhǔn)》（外科、婦科分冊），與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗方法一致，其含量測定均用絡(luò)合滴定法測定總鞣質(zhì)含量，本次研究制定的HPLC 法快速、簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于復(fù)方大紅袍止血膠囊的質(zhì)量控制。