miR-409-3p靶向調控MTF2基因在鼻咽癌細胞紫杉醇耐藥機制中的作用

肖 劍，陳亦龍，譚國林，宋業勛

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是我國南方各個省份及東南亞地區最常見的頭頸部惡性腫瘤之一。大部分患者發現時已經是中晚期[1]，單純放療效果欠佳，以放療為主、化療為輔的綜合治療是中晚期鼻咽癌患者的首選治療策略[2]。然而，臨床上往往出現的化療耐藥現象，顯著降低了鼻咽癌患者的總體生存率。紫杉醇（Taxol）在鼻咽癌的治療中應用最為廣泛，因此深入闡明紫杉醇的耐藥機制具有重要意義。

微RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類短的、高度保守的內源非編碼 RNA（長度為19～25 個核苷酸），通過與靶標基因mRNA 的3’-非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）結合而參與基因表達的轉錄后調控[3]。miRNA 已被證明是解決不同惡性腫瘤中化學耐藥機制的有前途的治療靶點[4]。此外，研究表明特定miRNA的表達與抗癌藥物耐藥性的發展有關[5]。已有研究表明，miR-409-3p 在不同的腫瘤組織中既可能發揮抑癌作用，又可能發揮促癌作用，甚至當同一腫瘤處于生長期的不同階段時，miR-409-3p 在其中發揮的作用可能相反[6-9]。

目前有關miR-409-3p 在鼻咽癌耐藥中可能發揮的作用尚不清楚，因此本研究旨在探討miR-409-3p 與其靶基因MTF2 的調控關系，以及在鼻咽癌紫杉醇耐藥中的作用機制，以期為鼻咽癌化療耐藥逆轉提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

鼻咽癌親本細胞株CNE-1 和5-8F 由中南大學湘雅醫學院腫瘤研究所惠贈，對紫杉醇耐藥的細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 由本科室研究團隊前期用紫杉醇作為誘導劑，在體外以藥物大劑量沖擊和逐步增加劑量相結合的方法作用于人鼻咽癌細胞株構建獲得[10]。

胎牛血清及RPMI 1640 培養液購自美國Gibco 公司，紫杉醇注射液購自成都曼斯特生物科技有限公司，CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，TRIzol 試劑及反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司。miR-409-3p-抑制子（miR-409-3p-inhibitor）和陰性對照（negative control，NC）-inhibitor 以及實時熒光定量PCR試劑盒qRT-PCR Starter Kit 購自廣州銳博生物科技有限公司。miR-409-3p-模擬物（miR-409-3p-mimics）和NC-mimics、攜帶有MTF2 全基因的重組質粒pcDNA3.1-MTF2 和陰性對照pcDNA3.1-NC 購自上海吉凱基因化學技術公司；攜帶有野生型（wild type，WT）MTF2-3’-UTR（MTF2-WT）和突變型（mutant type，MUT）MTF2-3’-UTR（MTF2-MUT）的腎素熒光素酶報告質粒購自上海銳賽生物技術有限公司。兔抗人MTF2 單克隆抗體和GAPDH（內參照）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG 購自美國Licor 公司，蛋白預染指示劑Marker 購自美國Fermentas 公司，一抗和二抗稀釋液購自上海翊圣生物科技有限公司。Annexin Ⅴ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience 公司，Lipofect AMINE 3000 購自上海銳賽生物技術有限公司。

倒置光學顯微鏡為日本Olympus 公司產品，Novo-Cyte 流式細胞儀為美國ACEA 公司產品，電泳儀為美國Bio-Rad 公司產品，Mastercycle gradient PCR 儀為德國Eppendorf 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

鼻咽癌親本細胞（CNE-1 和5-8F）和鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞（CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol）培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養液中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中進行培養，待細胞長滿培養瓶底部或細胞融合度＞80%后傳代，取對數期、生長狀況良好的細胞進行后續實驗。

1.2.2 平板克隆實驗及CCK-8 法檢測鼻咽癌親本細胞及紫杉醇耐藥細胞對紫杉醇的敏感性

平板克隆實驗：收集鼻咽癌親本細胞株CNE-1 和5-8F 以及紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol，用培養液將細胞密度調整為333 個/mL，6 孔板中每孔均勻接種1.5 mL 細胞懸液；待細胞貼壁后每組細胞中加入不同濃度梯度的紫杉醇溶液（0、0.5、1、2、3、4、8 和12 nmol/L）進行處理，24 h 后撤掉紫杉醇溶液，加入新的完全培養液，繼續在培養箱中培養1 周左右；最后每孔中加入4%多聚甲醛溶液固定細胞15 min，再加入適量的結晶紫染色液將細胞染色10～15 min。將6 孔板置于低倍顯微鏡下計數＞10 個細胞的克隆數。計算克隆形成率并繪制平板克隆折線圖，克隆形成率（%）＝克隆數/接種細胞數×100%。

CCK-8 法檢測：收集4組細胞，將細胞懸液的密度調整為4×104個/mL，以每孔100 μL的細胞數均勻加入96 孔板中（其中空白組不接種細胞）；每個孔中加入不同濃度的紫杉醇溶液（0、0.5、1、2、3、4、8 和12 nmol/L）（其 中空白組和對照組不加紫杉醇溶液，每個濃度梯度設置5 個復孔），將96 孔培養板置于培養箱中培養48 h 后，吸除舊培養液；每孔中加入100 μL CCK-8 溶液（按1 ∶10 的體積比例配制），放入培養箱中繼續培養40～60 min，最后在免疫酶標儀波長450 nm 處檢測各孔細胞的D值，使用Graphpad Prism 7 軟件計算細胞存活率和紫杉醇對各株細胞的半數抑制濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）值。

1.2.3 實時熒光定量PCR 檢測miR-409-3p 在鼻咽癌親本細胞株及紫杉醇耐藥細胞株之間的表達差異

收集鼻咽癌親本細胞株CNE-1 和5-8F 及紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol，加入TRIzol 試劑，裂解提取細胞總RNA，并反轉錄為cDNA；取2 μL 制備獲得的cDNA 進行PCR 擴增：95 ℃預變性10 min，之后進行40 個循環（95 ℃變性2 s、60 ℃退火20 s、70 ℃延伸10 s）。引物序列：miR-409-3p 上游引物序列為5’-GCGAATGTTGCTCGGTGAG-3’，下 游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內參照U6 上游引物序列為5’-AGAGCCTGTGGTGTCCG-3’，下游引物序列為5’-CATCTTCAAAGCACTTCCCT-3’；MTF2 基因上游引物序列為5’-CTGGGATAGATTGCACCCTG-3’，下游引物序列為5’-ATTCGCAACCCAAACAAATGC-3’；內參照GAPDH基因上游引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游引物序列為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.2.4 細胞轉染

將鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 接種于6 孔板中，置于培養箱中培養，使用LipofectAMINE 3000 轉染試劑將miR-409-3p-inhibitor 和對照NC-inhibitor 分別轉入紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中，轉染流程見試劑盒提供的操作說明；采用實時熒光定量PCR 法檢測轉染效率，實驗流程同1.2.3 節，并用平板克隆實驗及CCK-8 法檢測抑制miR-409-3p 表達后的耐藥細胞對紫杉醇敏感性的變化，實驗流程同1.2.2 節。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-409-3p和MTF2 基因的相關性

通 過Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk 數據庫分別預測miR-409-3p 可能的下游靶基因，初步篩選miR-409-3p 的下游靶基因可能是MTF2。

將miR-409-3p-mimics、NC-mimics 與攜帶有MTF2-WT 和MTF2-MUT 的重組腎素熒光素酶報告質粒兩兩組合后共轉染5-8F 細胞，轉染方法同1.2.4 節；轉染48 h 后使用裂解緩沖液裂解細胞，然后記錄檢測數據。采用雙熒光素酶報告系統分析熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性作為內控參照。

1.2.6 實時熒光定量PCR 和蛋白質印跡法檢測抑制miR-409-3p 表達后對MTF2 mRNA 及蛋白質表達水平的影響，及MTF2 在鼻咽癌親本細胞株及紫杉醇耐藥細胞株的表達差異

將miR-409-3p-inhibitor 和NC-inhibitor分別轉入紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol中，轉染流程見試劑盒提供的操作說明；實驗分為4組：5-8F/Taxol ＋miR-409-3p-inhibitor組、5-8F/Taxol ＋NC-inhibitor組、CNE-1/Taxol ＋miR-409-3p-inhibitor組、CNE-1/Taxol ＋NC-inhibitor組，行實時熒光定量PCR 檢測抑制miR-409-3p對靶基因MTF2 mRNA 表達水平的影響，并檢測MTF2 mRNA 在鼻咽癌親本細胞和紫杉醇耐藥細胞中的表達差異，實驗流程同1.2.3 節。

同時行蛋白質印跡法檢測。收集上述各組細胞，加入胰蛋白酶消化后，用PBS 緩沖液清洗細胞3 次；加入RIPA 裂解液，收集細胞上清液，行SDS-PAGE 分離蛋白；電泳結束后將分離后的蛋白轉移至PVDF 膜上；將轉移膜置于搖床上用含5%牛血清白蛋白的封閉液封閉處理1 h；加入一抗[兔抗人MTF2 單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶1 000）和GAPDH（內參照）單克隆抗體（體積稀釋比例為1 ∶3000）]，4 ℃輕搖過夜；加入二抗[HRP 標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1 ∶15 000）]，室溫孵育1 h。二抗孵育完成后行熒光成像。

1.2.7 集落形成實驗及CCK-8 法檢測過表達MTF2 后的耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol對紫杉醇敏感性的變化

收集對數生長期的5-8F/Taxol 細胞和CNE-1/Taxol 細胞，用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，接種于6 孔板中（500/孔），24 h 后分別 將pcDNA3.1-MTF2 和pcDNA3.1-NC轉入5-8F/Taxol 細胞和CNE-1/Taxol 細胞，轉染流程參閱試劑盒提供的操作說明。采用平板克隆實驗及CCK-8 法檢測過表達MTF2 后的耐藥細胞對紫杉醇敏感性的變化，實驗流程同1.2.2 節。

1.2.8 FCM 法檢測

收集轉染6 h 后的5-8F/Taxol 細胞和過表達MTF2 的5-8F/Taxol 細胞，加入終濃度為2 nmol/L 的紫杉醇溶液處理48 h。采用AnnexinⅤ-FITC/PI 試劑盒染色5～15 min 后，上流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.2.9 統計學方法

應用SPSS 17.0 統計學軟件對獲得的數據進行統計學分析。所有的實驗均獨立重復3 次，實驗數據用± s表示。對于兩組間的均數的差異性檢驗應用兩獨立樣本t檢驗或者是兩配對樣本的t檢驗來進行統計學分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽癌親本細胞及紫杉醇耐藥細胞株對紫杉醇的敏感性

分別采用CCK-8 法和集落形成實驗檢測不同濃度的紫杉醇對鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 及其對紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 增殖能力的影響，并計算IC50值。結果（圖1）顯示，紫杉醇對親本細胞5-8F 和CNE-1 的IC50值分別為（0.54±0.63）nmol/L和（1.02±0.41）nmol/L，對耐藥細胞5-8F/Taxol 和CNE-1/Taxol 的IC50值分別為（7.04±0.43）nmol/L 和（8.52±0.56）nmol/L；與親本細胞相比，紫杉醇耐藥細胞株對紫杉醇的IC50值均明顯提高，差異有統計學意義（P值均＜0.05）。

有學者對無人駕駛時代進行了展望，“從長遠趨勢來看，無人駕駛普及后，交通擁堵的現象會大幅下降，車禍等問題也會相應緩解——有研究表明，當前90%以上的車禍都是人為因素引起的。”[10]谷歌研制無人駕駛汽車的動機與出發點就是降低交通事故的發生率，至于無人駕駛時代，是否就消滅了道路交通違法犯罪，難以預料。2016年2月14日谷歌無人駕駛汽車發生交通事故，2016年5月7日美國特斯拉汽車自動駕駛汽車發生事故并造成駕駛員死亡，2017年3月24日優步無人駕駛汽車發生交通事故。這些案例將無人駕駛推上了風口浪尖，在無人駕駛時代，現行刑法的交通肇事罪的適用值得研究。

2.2 miR-409-3p 在鼻咽癌親本細胞株及紫杉醇耐藥細胞株之間的表達差異及miR-409-3p 與鼻咽癌紫杉醇耐藥性之間的關系

采用實時熒光定量PCR 法檢測miR-409-3p在鼻咽癌親本細胞株CNE-1 和5-8F 及紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 之間的表達水平的差異。結果（圖2A）顯示，鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p 的表達水平明顯高于親本細胞株CNE-1和5-8F，差異具有統計學意義（P值均＜0.001）。

為進一步明確miR-409-3p 可能參與鼻咽癌的紫杉醇耐藥過程，在鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中轉染miR-409-3pinhibitor，并行實時熒光定量PCR驗證。結果（圖2B）顯示，耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol中miR-409-3p-inhibitor組的miR-409-3p 的表達水平均明顯低于NC-inhibitor組，差異具有統計學意義（P值均＜0.001）。

行CCK-8 實驗檢測抑制紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表達后，鼻咽癌細胞對紫杉醇耐藥性的變化。結果（圖2C）顯示，NC-inhibitor組中紫杉醇對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（6.92±0.45）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（7.51±0.21）nmol/L；miR-409-3p-inhibitor組中紫杉醇 對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（1.85±0.33）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（2.52±0.31）nmol/L。

行集落形成實驗再次檢測抑制miR-409-3p表達后鼻咽癌細胞對紫杉醇耐藥性的變化。結果（圖2D）顯示，NC-inhibitor組中紫杉醇對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（7.23±0.25）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（7.72±0.39）nmol/L；miR-409-3p-inhibitor組中紫杉醇 對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（1.30±0.37）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞r 的IC50值為（2.20±0.45）nmol/L。

上述結果表明，抑制紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表達后鼻咽癌細胞對紫杉醇的耐藥性明顯降低。

Fig.1 The cell viability of nasopharyngeal carcinoma parental cells (5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells(5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) treated with different concentrations of taxol for 48 h was detected by CCK-8 assay(A) and colony formation assay (B) (n=3).圖1 分別采用CCK-8 法（A）和集落形成實驗（B）檢測不同濃度紫杉醇對鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 以及紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 存活能力的影響

Fig.2 The expression level of microRNA (miR)-409-3p in nasopharyngeal carcinoma parental cells (5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (A).The expression level of miR-409-3p in CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with miR-409-3pinhibitor was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (B).The change in sensitivity to taxol was detected by CCK-8 assay (C) and colony formation assay (D).CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC)-inhibitor were taken as the controls.***P<0.001 (n=3).圖2 實時熒光定量PCR 法檢測miR-409-3p 在鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表達水平（A）、轉入miR-409-3p-inhibitor 對細胞中miR-409-3p 表達水平的影響（B）以及CCK-8 法（C）和集落形成實驗（D）檢測沉默miR-409-3p 表達對紫杉醇耐藥細胞耐藥性的影響

2.3 miR-409-3p 靶基因的預測與驗證

前期研究提示，miR-409-3p 在鼻咽癌耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表達水平明顯高于鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F。通過Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk數據庫分別預測miR-409-3p 可能的下游靶基因，共預測得出10 個共同靶基因（ATXN3、ELF2、GAB1、GNAL、MTF2、NUFIP2、RDX、SEC62、ZEB1 和ZFHX4）（圖3A）。鑒于此，通過實時熒光定量PCR 初步篩選miR-409-3p 的下游靶基因在鼻咽癌親本與耐藥細胞中的差異表達，發現MTF2 mRNA 在鼻咽癌耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中低表達，與miR-409-3p 的表達水平呈相反趨勢。因此，本研究選擇MTF2 作為miR-409-3p 的靶基因進行后續研究。用實時熒光定量PCR 檢測耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中抑制miR-409-3p表達后對靶基因MTF2 表達水平的影響。結果（圖3B）顯示，miR-409-3p-inhibitor組中MTF2 mRNA 的表達水平明顯上調（P值均＜0.01）。

采用蛋白質印跡法進一步檢測耐藥細胞株CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中抑制miR-409-3p表達后MTF2 蛋白的表達水平。結果（圖3C）顯示，miR-409-3p-inhibitor組5-8F/Taxol 細胞中MTF2 蛋白的相對表達量為0.791±0.131，CNE-1/Taxol 細胞中為0.402±0.115；NCinhibitor組5-8F/Taxol 細胞中MTF2 蛋白的相對表達量為0.113±0.102，CNE-1/Taxol 細胞中為0.192±0.124；這一結果表明，與NC-inhibitor組相比，miR-409-3p-inhibitor組細胞中MTF2 蛋白質的表達水平均明顯上調（P＜0.01 和P＜0.05）。

2.4 MTF2 與鼻咽癌紫杉醇耐藥性之間的關系

Fig.3 Targetscan,miRDB,miRTarBase and miRWalk databases were used to analyze the target gene of microRNA(miR)-409-3p (A).The expression levels of MTF2 mRNA (B) and protein (C) in taxol-resistant nasopharyngeal carcinoma cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) transfected with miR-409-3p-inhibitor were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.Luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miR-409-3p and MTF2 gene (D).*P<0.05,**P<0.01 (n=3).圖3 利用miRNA 靶基因預測網站預測miR-409-3p 的靶基因（A），采用實時熒光定量PCR 法（B）和蛋白質印跡法（C）檢測沉默miR-409-3 表達后對耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中MTF2 mRNA及蛋白表達水平的影響，熒光素酶報告基因檢測miR-409-3p 與MTF2 之間的靶向關系（D）

Fig.4 The expression levels of MTF2 mRNA (A) and protein (B) in nasopharyngeal carcinoma parental cells(5-8F and CNE-1) and taxol-resistant cells (5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting,respectively.The expression level of MTF2 mRNA in 5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol cells transfected with pcDNA3.1-MTF2 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (C).The change in sensitivity to taxol in 5-8F/Taxol and CNE-1/Taxol cells with MTF2 overexpression was detected by CCK-8 assay (D) and colony formation assay (E).CNE-1/Taxol and 5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC)(pcDNA3.1-NC) were taken as the controls.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.圖4 分別采用實時熒光定量PCR 法（A）和蛋白質印跡法（B）檢測MTF2 mRNA 及蛋白在鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中的表達水平。實時熒光定量PCR 法檢測轉入重組載體pcDNA3.1-MTF2 對CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 細胞中MTF2 mRNA 表達水平的影響（C），CCK-8 法（D）和集落形成實驗（E）檢測MTF2 過表達后CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 細胞對紫杉醇敏感性的變化

分別采用實時熒光定量PCR 和蛋白印跡法檢測MTF2 mRNA 和蛋白在鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 和紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 中的表達差異。實時熒光定量PCR 檢測結果（圖4A）顯示，MTF2 mRNA 在親本細胞中的表達水平均明顯高于紫杉醇耐藥細胞（P＜值均0.01）。蛋白質印跡法檢測結果（圖4B）顯示，MTF2 蛋白的相對表達量，在親本CNE-1 細胞中為0.91±0.11，耐藥CNE-1/Taxol 細胞中為0.41±0.21，親本5-8F 細胞中為0.59±0.24，耐藥5-8F/Taxol 細胞中為0.2±0.12；MTF2 蛋白在親本細胞中的表達水平均明顯高于紫杉醇耐藥細胞（P值均＜0.05）。上述結果表明，MTF2 可能參與了鼻咽癌對紫杉醇的耐藥。

將pcDNA3.1-MTF2 和陰性對照pcDNA3.1-NC 分別轉入耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中，行實時熒光定量PCR法檢測對耐藥細胞中的MTF2 mRNA 表達水平的影響。結果（圖4C）顯示，pcDNA3.1-MTF2組耐藥細胞中MTF2 mRNA 的表達水平均較對照組明顯上調（P值均＜0.001）。進一步行CCK-8 法檢測耐藥細胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 中過表達MTF2 后細胞對紫杉醇藥物敏感性的變化，結果（圖4D）顯示，對照組（pcDNA3.1-NC組）中紫杉醇對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（6.75±0.42）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（8.82±0.23）nmol/L；pcDNA3.1-MTF2組中紫杉醇對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（1.84±0.29）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（1.53±0.47）nmol/L。相應的集落形成實驗結果（圖4E）顯示，對照組（pcDNA3.1-NC組）中紫杉醇對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（6.93±0.52）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（7.93±0.51）nmol/L；pcDNA3.1-MTF2組中紫杉醇對5-8F/Taxol 細胞的IC50值為（1.92±0.48）nmol/L，對CNE-1/Taxol 細胞的IC50值為（1.21±0.44）nmol/L。與陰性對照組細胞相比，耐藥細胞中過表達MTF2 后，紫杉醇5-8F/Taxol 和CNE-1/Taxol細胞的IC50值均明顯降低，差異具有統計學意義（P值均＜0.05）。

上述結果提示，MTF2 參與了鼻咽癌細胞對紫杉醇的耐藥，鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中上調MTF2 的表達水平后其紫杉醇的耐藥性被降低。

2.5 MTF2 與細胞凋亡之間的關系

用紫杉醇（2 nmol/L）分別處理轉入重組載體pcDNA3.1-MTF2組和陰性對照pcDNA3.1-NC 的5-8F/Taxol細胞，48 h 后采用FCM 檢測細胞的凋亡情況。結果（圖5）顯示，細胞的凋亡率由MTF2 陰性對照組的3.05% 提高到MTF2 過表達組的8.47%，2組差異有統計學意義（P＜0.05）。這一結果結果表明，過表達MTF2 可以促進紫杉醇誘導的鼻咽癌細胞的凋亡，從而促進了鼻咽癌細胞對紫杉醇的敏感性。

Fig.5 The apoptosis rate of taxol-resistant 5-8F/Taxol cells transfected with pcDNA3.1-MTF2 was detected by FCM.5-8F/Taxol cells transfected with negative control (NC) (pcDNA3.1-NC) were taken as the control.圖5 FCM 檢測紫杉醇對MTF2 過表達的紫杉醇耐藥細胞5-8F/Taxol 凋亡率的影響

3 討論

鼻咽癌治療中出現紫杉醇耐藥是一個長期存在的臨床問題，而獲得性耐藥的發生是患者化療療效欠佳的重要原因[11-12]。有報道提示，miRNAs 能改變腫瘤細胞對化學治療的敏感性，miRNA 上調或者miRNA 沉默都可能增加化療的效果[13]，考慮到紫杉醇在鼻咽癌治療方面的廣泛應用，尋找紫杉醇耐藥的治療靶點對提高臨床療效具有重要意義，因此本文重點探討了miR-409-3p 在鼻咽癌紫杉醇耐藥中的作用。

既往研究表明，miR-409-3p 可調控腫瘤細胞的增殖、細胞凋亡以及細胞的遷移和侵襲等[14-18]。BAI 等[19]研究發現，miR-409-3p 在結腸癌癌組織中的表達較正常組織低，其靶基因GRB2 相關結合蛋白可介導多條信號轉導途徑，與生長因子、細胞因子和抗原受體等多種受體結合，調節細胞生長分化，從而抑制結腸癌細胞的轉移與侵襲。然而關于miR-409-3p 在鼻咽癌中的發揮的作用目前尚不清楚，本課題組以鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 以及耐藥細胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol 為研究對象，驗證耐藥細胞有足夠的耐藥性，發現耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p 的表達水平明顯高于親本細胞CNE-1 和5-8F；隨后通過抑制耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中miR-409-3p的表達水平后發現，細胞對紫杉醇的耐藥性降低，表明miR-409-3p 在鼻咽癌的耐藥過程中可能發揮一定的作用。但是miR-409-3p 影響鼻咽癌紫杉醇耐藥性的機制尚不清楚。

為了進一步研究miR-409-3p 的潛在靶點和其分子作用機制，本研究中通過在線數據庫預測和雙熒光素酶報告基因實驗證實了MTF2 是miR-409-3p 的直接功能靶點。SEKYERE 等[20]的研究表明，MTF2 在各種疾病患者的血清中存在，但是其生物學功能仍有待研究。MAGANTI等[21]研究發現，MTF2 可調節白血病化療的耐藥性。本研究中發現，MTF2 在鼻咽癌親本細胞CNE-1 和5-8F 中的表達水平明顯高于耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol；過表達耐藥細胞CNE-1/Taxol 和5-8F/Taxol 中MTF2 的表達水平后發現，細胞耐藥性降低。本研究中發現，MTF2 與miR-409-3p 在mRNA 及蛋白的表達水平均呈負相關性，說明在鼻咽癌細胞中miR-409-3p 可能抑制MTF2 的表達，MTF2 是miR-409-3p 的潛在靶基因。

化療藥物促進腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤治療的重要機制之一[22]。腫瘤細胞耐藥的主要機制與跨膜蛋白的過表達密切相關，這些蛋白質可以直接降低細胞內化療藥物的濃度[23]。放化療主要是通過調節相關跨膜蛋白表達，促進腫瘤細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤作用[24]。此外，MAGANTI 等[21]研究發現，MTF2 可調節p53 信號通路改變細胞生長周期和凋亡水平而改變化療的敏感性，使白血病對誘導化療藥物敏感。為進一步探索鼻咽癌紫杉醇耐藥與細胞凋亡之間的關系，本研究中構建了MTF2 過表達的耐藥細胞5-8F/Taxol，結果顯示過表達MTF2 后5-8F/Taxol 細胞凋亡率較對照組明顯提高，表明上調MTF2 表達可促進鼻咽癌紫杉醇耐藥細胞的凋亡。

綜上所述，本研究發現miR-409-3p 靶向負調控MTF2 的表達，抑制此信號軸可以促進紫杉醇誘導的細胞凋亡，可作為逆轉鼻咽癌化療耐藥的靶分子，為鼻咽癌患者建立新的治療策略提供了前期理論基礎。