肺腺癌患者預后及EGFR基因T790M突變狀況的相關因素分析

耿一萌，孟 軻，王一迪；楊珍珍，梅葉玲，張騰飛，馬 望

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，給人類生命健康帶來嚴重危害[1]。大約85%的肺癌為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]，其中肺腺癌為NSCLC 中主要的亞型之一。在亞洲，近50% 晚期NSCLC 患者中存在表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變[3]，EGFR-酪 氨酸激酶抑制（EGFR-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）靶向治療對該類患者具有顯著的療效，但耐藥性限制了靶向治療療效[4]。最常見的耐藥機制是在EGFR基因20 外顯子位點790中甲硫氨酸取代了蘇氨酸，即發生了T790M 突變[5]，然而目前臨床上仍有部分耐藥患者無法行二次基因檢測或因檢測結果假陰性，導致無法明確T790M 基因突變狀況。因此，探索影響患者接受EGFR-TKIs 治療療效的預后因素及耐藥性T790M 突變等生物標志物，對指導臨床診療具有重要意義。

臨床上容易獲得的臨床病理特征是目前有潛力的疾病預測因子。較多研究發現臨床合并指數與腫瘤風險和預后相關，如在一定程度上反映體內炎性水平的中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil lymphocyte ratio，NLR）、血 小板與淋巴細胞比值（platelet lymphocyte ratio，PLR）以及單核細胞與淋巴細胞比值（monocyte lymphocyte ratio，MLR）等[6-7]，但在接受EGFR-TKIs 靶向治療的NSCLC 患者中尚未有相關研究報道。同上有研究顯示，肝酶不僅能反映患者的肝功能，也在一定程度上參與患者代謝及免疫狀況，較多回顧性研究發現肝酶可以預測各種癌癥預后[8-9]，但在肺癌患者中的報道較少。目前已證實，臨床上攜帶敏感EGFR突變的NSCLC 大多具有以下特征：女性、從不吸煙、東亞人和病理類型為肺腺癌[10]，但在第一代EGFR-TKIs 耐藥的肺癌患者中，尚未有研究報道與T790M 耐藥突變相關的臨床特征。因此希望開展本研究，以探討簡單的臨床病理因素是否可作為肺腺癌患者EGFR-TKIs 靶向治療預后及EGFR-TKIs 耐藥后T790M 突變狀況的預測因子。

1 資料與方法

1.1 患者資料

收集2015 年1 月—2018 年12 月就診于本院的137例肺腺癌患者的資料。納入標準：（1）病理和組織學證實為肺腺癌，發生遠處轉移，臨床TNM 分期為Ⅳ期；（2）根據下一代測序（next generation sequencing，NGS）結果提示，所有患者均為EGFR基因的19 外顯子缺失突變（19Del）或21 外顯子L858R 點突變（21L858R），無其他復雜突變及T790M 突變；（3）初治應用第一代EGFR-TKIs 藥物[吉非替尼片（gefitinib）或者鹽酸埃克替尼片（icotinib）]治療；（4）至少有一個可評估的病變；（5）有足夠的骨髓、腎臟和肝臟功能；（6）臨床資料和隨訪資料完整。排除標準：腦轉移患者、肝轉移患者、預計生存期＜3個月或臨床資料和隨訪資料不完整的患者。

1.2 收集的臨床病理特征

收集患者年齡、性別、吸煙史、器官轉移的數量、EGFR突變類型、EGFR-TKIs 藥物、Ki-67 增殖指數，淋巴細胞計數、血小板計數、中性粒細胞計數、單核細胞計數、血清白蛋白以及γ-谷氨酰轉肽酶（gamma-glutamyl transferase，γ-GGT）等臨床指標；以及由實驗室檢驗指標計算出的臨床參數：PLR ＝外周血血小板計數（×109/L）/ 外周血淋巴細胞計數（×109/L），NLR ＝外周血中性粒細胞計數（×109/L）/ 外周血淋巴細胞計數（×109/L），MLR ＝外周血單核細胞計數（×109/L）/ 外周血淋巴細胞計數（×109/L），營養預后指數（prognostic nutritional index，PNI）＝血清白蛋白值（g/L）＋5×外周血淋巴細胞計數（×109/L）。

1.3 外周血及病理組織檢測方法

在治療前1 周內，清晨采集所有研究對象的空腹靜脈血，用真空采集管分別收集靜脈血2及4 mL。采用血細胞分析儀檢測淋巴細胞計數，血小板計數，中性粒細胞計數，單核細胞計數；雙縮脲法檢測血清白蛋白；采用IFCC 速率法檢測γ-GGT。患者行組織活檢術取得腫瘤組織標本，應用免疫組織化學法檢測Ki-67 的表達水平。

1.4 治療方法

所有患者均接受第一代EGFR-TKIs 藥物治療，根據患者意愿選擇吉非替尼或者鹽酸埃克替尼[ 吉非替尼片（批準文號：國藥準字J20 100014；生產廠家為AstraZeneca UK Limited）；口服250 mg/次，1 次/d；鹽酸埃克替尼（批準文號：國藥準字H20 110061；生產廠家為貝達藥業股份有限公司）；口服125 mg/次，3 次/d]。患者在治療期間可以根據病情給予止痛和營養等對癥支持治療，但不予其他抗腫瘤治療，用藥持續到無法耐受藥物不良反應或病情進展為止。4 周為1 個療程，前2 個療程每次結束后均行影像學復查，之后每2 個療程行影像學復查1 次。

1.5 療效評估與隨訪

基于實體瘤療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）（版本1.1），應用計算機斷層掃描（computed tomography，CT）評估病情。主要終點是無進展生存期（progression free survival，PFS），即患者從接受治療開始，至疾病進展或者發生因為任何原因的死亡之間的時間。通過調取患者CT 影像或打電話以獲取患者疾病進展情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 統計學軟件對研究數據進行統計學分析。應用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并計算生存率，采用logrank 法進行組間生存率差異的比較；使用COX比例風險回歸模型進行多因素生存分析。Fisher確切概率法用于分類變量的相關性分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者特征

137例患者中男性51例（37.2%），女性86例（62.8%）；中位年齡為59 歲（范圍：30～83歲）；EGFR基因19Del 突變者73例（53.3%），21L858R 突變者64例（46.7%）；Ki-67 增殖指數中位數為30%（范圍：5%～90%）。γ-GGT 中位值為22.00 U/L（范圍：4.93～155.00 U/L），正常值為0～58 U/L，本研究中以58 U/L 為臨界值，按γ-GGT 值將患者分為2組[即正常組121例（88.3%），異常組16例（11.7%）]。根據患者治療前血液學檢驗結果計算獲得指標：中位PLR 值為146.5（范圍：51.9～723.0），中位NLR 值為2.62（范圍：0.12～25.00），中位MLR 值為0.34（范圍：0.02～3.55），中位PNI 值為48.4（范圍：29.5～61.9）。臨床病理特征詳見表1。

表1 137例肺腺癌患者的臨床病理特征Table 1 Clinicopathological features of 137 patients with lung adenocarcinoma(N ＝137)

截至隨訪結束，有53例（38.7%）患者出現疾病進展，84例（61.3%）患者病情穩定或緩解，全組患者的中位PFS 時間為16.0 個月（1～51月），平均PFS 期為9.1 個月。

2.2 生存分析

2.2.1 單因素分析

應用log-rank 法進行單變量生存分析以確定與PFS 有關的臨床特征，結果（表2）提示患者吸煙與否、治療前轉移器官個數、Ki-67增殖指數及γ-GGT 水平與PFS 期有關（P值均＜0.05），然而EGFR突變類型、年齡、性別、TKIs 藥物類型及NLR、PLR、MLR、PNI 在預測PFS 方面，差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。

表2 肺腺癌患者的單因素生存分析Table 2 The univariate analysis of PFS in the patients with lung adenocarcinoma(N ＝137)

Kaplan-Meier 法分析結果顯示，γ-GGT 值異常者的PFS 期為9.0 個月，短于γ-GGT 值正常者（17.0 個月）差異有統計學意義（P＝0.003）（圖1）；Ki-67 增殖指數≤50%患者的中位PFS期為7.0 個月，明顯短于Ki-67 增殖指數≥50%者（PFS 期為18.0 個月）（P＜0.001）（圖1B）；僅有1 個器官轉移與至少有2 個器官轉移者的中位PFS 期分別為17.5 和10.0 個月（P＝0.008）（圖1C）；不吸煙者的中位PFS 期為11.0 個月，不吸煙者的中位PFS 期為17.0 個月（P＝0.004），不吸煙者比吸煙者多6.0 個月（圖1D）。

Fig.1 The association of γ-GGT expression level (A),Ki-67 index (B),number of organ metastasis (C)and smoking status (D) with PFS in 137 patients with lung adenocarcinoma.PFS:Progression-free survival;γ-GGT:Gamma-glutamyl transferase.圖1 137例肺腺癌患者的γ-GGT 表達水平（A）、Ki-67 增殖指數（B）、器官轉移個數（C）和吸煙狀況（D）與PFS 的關系

2.2.2 多因素分析

把單因素生存分析結果里對患者PFS 有影響的指標γ-GGT、Ki-67 增殖指數、器官轉移及吸煙史納入COX多因素分析。結果（表3）顯示，Ki-67 增殖指數、γ-GGT 和器官轉移個數為獨立的預后因素（P值均＜0.05）。

表3 137例肺腺癌患者預后的多因素分析Table 3 The multivariate analysis of progression-free survival (PFS) in 137 patients with lung adenocarcinoma

2.3 各指標與進展后T790M 的關系

137例患者中有53例患者出現疾病進展，其中有32例患者進行了二次組織活檢行基因檢測，19例（59.4%）患者發生T790M 突變陽性，13例（40.6%）患者為T790M 突變陰性。根據Fisher 確切概率法分析顯示，年齡與T790M 突變狀態有關（P＝0.029），差異有統計學意義（表4）；這一結果提示，在一代EGFR-TKIs 靶向治療進展后的患者中，年齡＜65 歲的患者更可能發生T790M 突變。

表4 53例肺腺癌患者的臨床病理特征與T790M 突變之間的關系Table 4 Relationship between clinicopathological features and T790M mutation in 53 patients with lung adenocarcinoma[n(%)]

3 討論

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，最有效的治療方法是手術[1]，然而，約70%的肺癌患者在診斷時已是局部晚期或發生轉移，不適合手術治療。近年來，靶向治療的進展為晚期肺癌患者提供了新的治療方案，尤其EGFR-TKIs 已被推薦作為具有EGFR敏感突變患者的一線治療方案，與傳統放化療相比具有明顯的疾病緩解率和生存優勢。然而，患者接受EGFR-TKIs 治療后往往出現耐藥，PFS 僅為9～14 個月[4]。因此，早期預測患者靶向治療預后，對于改善生存具有重要意義。在耐藥患者中，有超過50%患者的耐藥機制是因獲得了T790M 突變，但由于組織活檢為有創性操作，且T790M 檢測具有假陰性，部分耐藥患者因無足夠的臨床證據未能接受第三代EGFR-TKIs 靶向治療，預后較差，因此探索T790M 突變相關影響因素具有重要意義。

本文回顧性分析了137例接受第一代EGFRTKIs 藥物的晚期肺腺癌患者，單因素生存分析結果顯示不同吸煙狀況，治療前轉移器官數目，不同Ki-67 增殖指數和γ-GGT 水平均為患者預后的重要影響因素，其中吸煙、多發器官轉移、高水平Ki-67 增殖指數和高水平γ-GGT 的患者預后差，這與先前的研究一致。COX多因素生存分析結果顯示，器官轉移數目、Ki-67 增殖指數和γ-GGT 是接受第一代EGFR-TKIs 的肺腺癌患者PFS 的獨立預后因素。眾所周知，不吸煙患者較吸煙患者更易發生EGFR突變[11]，而在EGFR敏感突變的晚期NSCLC 患者中，一項薈萃分析結果表明不吸煙患者的PFS 長于吸煙患者[12]，最常見的原因是非吸煙患者具有較高的EGFR突變率，在本研究中吸煙患者和不吸煙患者的中位PFS 分別為11 和17 個月，差異具有統計學意義，再次驗證了EGFR-TKIs 靶向治療在吸煙和不吸煙患者中具有不同的療效，不吸煙患者在一線EGFR-TKIs 靶向治療中具有更長的PFS。一項韓國研究結果表明，對于接受EGFR-TKIs 靶向治療的晚期NSCLC 患者，非重度吸煙患者的PFS 比重度吸煙患者更好[13]，而本研究僅收集吸煙狀態的數據，在以后的研究中可進一步收集吸煙時間和吸煙量來分析吸煙指數對預后的影響。Ki-67 增殖指數是目前評價腫瘤細胞增殖最可靠的免疫組織化學標志物，其蛋白表達水平和腫瘤惡性程度有關，在判斷癌癥的侵襲、轉移及預后方面具有重要作用，有研究顯示在亞洲早期肺腺癌患者中，Ki-67 高表達與總生存率及PFS 呈負相關[14]；ZHANG 等[15]研究結果提示，在接受EGFR-TKIs 靶向治療的晚期肺腺癌患者中，較低的Ki-67 指數提示預后良好。本研究中發現，Ki-67 指數是晚期肺腺癌患者EGFR-TKIs 靶向治療的獨立預后因素，Ki-67 表達水平≥50%與表達水平＜50%患者的中位PFS 分別為7 和18 個月，差異具有明顯的統計學意義，Ki-67 高表達者預后較差，這與先前研究結論一致。γ-GGT 是一種膜依賴性酶，主要來自肝臟，參與抗氧化劑谷胱甘肽的分解代謝，其促氧化和促炎特性被認為是導致不良疾病結局的病因機制。有研究表明，γ-GGT 與多種癌癥患者生存預后呈負相關，如胰腺癌[16]、直腸癌[17]和卵巢癌[18]等。γ-GGT 在肺癌中的研究較少，BOZKAYA 等[19]發現，高血清γ-GGT 水平是轉移性NSCLC 患者總生存期和PFS 的獨立不良預后因素，但在該研究中排除了接受EGFR-TKIs 靶向治療的患者。本研究中分析了γ-GGT 水平對晚期肺腺癌患者EGFRTKIs 靶向治療療效的影響，結果表明高水平γ-GGT 患者與低水平γ-GGT 患者的中位PFS 分別為9和17個月，差異具有統計學意義（P＝0.003），COX多因素分析結果提示，γ-GGT 水平是患者的獨立預后因素（HR＝3.938，P＝0.001）。臨床上常以58 U/L 來作為血清γ-GGT 正常水平的臨界值，本研究以此為截斷點，發現具有異常γ-GGT 水平的患者預后差，由于本研究在納入患者時已排除肝轉移者，因此結果具有較低偏差；且由于血清γ-GGT 是氧化應激的標志，一定程度上反映了腫瘤細胞的代謝狀況，在預后癌癥預后方面具有重要價值。

對第一代或第二代EGFR-TKIs 靶向治療耐藥的NSCLC 患者有半數發生耐藥性T790M 突變[20]這一研究結果，本研究中對137例患者中有53例發生疾病進展，其中32例患者進行了二次基因測序，結果顯示19例患者為T790M 突變陽性，突變率為59.4%，這與先前結果基本相符。另有研究表明，T790M 突變狀態與L858R具有關聯性[21]，而在本研究中，可能樣本較少的原因，未發現T790M 突變狀態與患者原突變類型的差異。但本研究中發現，患者年齡與T790M 突變狀態相關（P＝0.029），差異有統計學意義。DAL MASO 等[22]針對高加索人群的研究發現，患者年齡與繼發性T790M 突變陽性相關，年齡＜65 歲者更易發生T790M 突變。本研究中，基于中國人群得出了相同結論，即患者年齡與T790M 突變狀況相關，年齡＜65 歲的患者T790M 突變率高于年齡≥65 歲的患者。然而一項基于日本人的研究結果表明，≥75 歲患者的耐藥性T790M 突變率高于年輕患者[23]，該研究人群中位年齡為70 歲，而本研究人群中位年齡為59 歲，可能由于人群年齡的差異導致結果的不一致，這需要后續大樣本量研究來探索年齡與耐藥性T790M 突變的關系。本研究結果表明，年齡與T790M 突變狀況相關，對于此類患者可推薦行第二次基因檢測，或基因檢測結果不理想的情況下推薦患者應用第三代TKIs 治療。

盡管本研究結果表明，吸煙狀態、Ki-67 增殖指數及γ-GGT 水平在接受一線EGFR-TKIs 靶向治療的EGFR突變型肺腺癌患者中的預后價值，以及年齡與T790M 的相關性，但仍存在一定的局限性。首先，這是一個單中心回顧性研究，樣本量相對較小，各組之間的不平衡可能會給結果帶來一些偏差；其次，臨界值與以前的研究不同，這使得很難將本研究結果與其他研究進行比較；研究僅收集了患者的PFS 資料，由于失訪率較高，限制了本研究對總生存期資料的收集，在今后的研究中會擴大樣本量，補充多總生存期影響的研究。由于該領域大多數研究為回顧性，因此仍需要更大樣本量的多中心前瞻性研究來進一步驗證吸煙狀態、Ki-67 增殖指數及γ-GGT 水平在接受一線EGFR-TKIs 靶向治療的肺腺癌患者中的預后價值，以及年齡對T790M 突變狀況的影響。