同種異體CAR-T細胞的研究進展

方雅玲，董宇倩，王亞男，吳維怡

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）-T 細胞技術代表了癌癥免疫治療領域的重大突破。采用合成生物學的方法，免疫細胞表達經工程改造的CAR，CAR-T 細胞進入腫瘤部位，特異性識別并殺死腫瘤細胞，并進一步促進腫瘤抗原的釋放，由此觸發CAR-T 細胞的廣泛增殖，并激活免疫系統引發進一步的抗腫瘤反應[1]。目前，已獲美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的2 款CAR-T 細胞[美國諾華公司（Novartis）的CTL019（商品名：Kymriah?）和美國風箏制藥公司（Kite Pharma）的Axi-Cel（商品名：Yescart?）]已用于治療復發或難治性B 細胞急性淋巴母細胞性白血病，復發或難治性彌漫性大B 細胞淋巴瘤和原發縱隔大B 細胞淋巴瘤[2-3]，但使用的都是自體CAR-T 細胞制備技術。自體CAR-T 細胞治療需要為每個患者定制生產過程，生產成本因無法規模化而居高不下；生產周期較長，某些高度增殖性疾病（例如急性白血病）患者可能會錯過最佳治療窗口；有些患者自身的T 細胞存在數量缺陷或細胞功能障礙，導致CAR-T 細胞的質量得不到保證。在這種治療背景下，同種異體CAR-T 細胞療法應運而生。同種異體CAR-T（allogeneic CAR-T），又稱通用型CAR-T（universal CAR-T）和即用型CAR-T（off-the-shelf CAR-T）是指將來源于外周血和臍帶血[4]，或者衍生自可再生干細胞的T 細胞[5]，進行基因改造后使其既能規避移植物抗宿主和宿主排斥，又能發揮既定的抗癌作用。該免疫療法在過去幾年中的代表性里程碑事件見表1。

表1 同種異體CAR-T 細胞發展的里程碑事件Table 1 Milestone in the development of CAR-T cells

通用型CAR-T 細胞移植的最大障礙在于移植物抗宿主病（graft-versus-host disease）和宿主排斥異源T 細胞。一方面，輸入患者體內的同種異體T 細胞上的T 細胞受體（T-cell receptor，TCR）能夠識別患者的同型抗原，從而引發GvHD；另一方面，患者自身的免疫細胞可能會識別CAR-T 細胞表面上的組織相容性人白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），從而攻擊輸入體內的CAR-T 細胞，導致免疫排斥。因此，本文將就近年來通用型CAR-T 技術在規避GvHD 和免疫排斥異源T 細胞方面的研究發展及臨床前景進行綜述。

1 通過基因編輯靶向敲除TCR 以規避GvHD

通用型CAR-T 技術主要依賴于基因編輯平臺來解決GvHD。在基因組中特異性地造成雙鏈缺口，然后采用非同源末端連接或同源模板重組修復，從而實現TCR 的靶向敲除并減少或消除GvHD。當前，存在3 種成熟的用于產生TCR缺陷型T 細胞的基因編輯方法：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）法、轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effectorbased nucleases，TALENs）法和規律性間隔的短回文序列重復簇（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）法。ZFNs是一類經過特殊設計的DNA 內切酶，其可以導致目標基因的雙鏈斷裂，然后通過非同源末端連接或同源重組修復斷裂位點，引起核苷酸的缺失或插入，從而使靶基因功能喪失。主要功能：（1）通過改進專性異二聚體結構增強鋅指核酸酶活性；（2）利用鋅指酶來進行基因編輯；（3）快速構建鋅指核酸酶的重組鋅指陣列。TALENs 具有與ZFNs 類似的結構和功能，由特異性的DNA結合蛋白TALE 和行使DNA 切割功能的Fok Ⅰ核酸內切酶組合而成。主要功能：（1）不再像TAL-type Ⅲ effectors 一樣依賴于通過結合特定的DNA 堿基組合來進行基因編輯；（2）一個簡單的密碼控制著TAL 效應器的識別；（3）通過TALE 核酸酶對人多能細胞進行基因編輯。基于ZFNs 和TALENs 的方法都需要為每個新的基因靶點設計特定的核酸酶對，這限制了該技術的廣泛應用。CRISPR-Cas 系統是從原核生物進化獲得的一套特有天然免疫系統，通過小的CRISPR RNAs 靶向抵抗病毒侵襲，如今被修飾成靶向哺乳動物細胞DNA，可實現對DNA 序列的修剪、切割、替換或添加。該技術可對人類細胞中的 RNA 程序化基因組進行編輯；使用 CRISPR/Cassystems 對多重基因組進行編輯；通過 Cas9對 RNA 引導的人類基因組進行編輯；使用 Cas9 RNA 引導的核酸內切酶在人類細胞中進行靶向基因組的編輯。該系統只需要設計一個靶向目標序列的單導核酸（single-guide RNA，sgRNA）就能引導Cas 核酸酶作用于相應的結合位點。

TCR 蛋白復合物由α 鏈和β 鏈（在αβT 細胞中）或γ 鏈和δ 鏈（在γδT 細胞中）組成，并與諸如CD3 蛋白的輔助分子相關。由于αβTCR受體需要形成異二聚體才能表達功能性細胞表面分子，因此敲除TCR 恒定α 鏈（TCR alpha constant，TRAC）或β 鏈（TCRbeta constant，TRBC）足以消除αβTCR 的表達。但是考慮到β鏈基因包含2 個恒定區，而編碼α 鏈的基因只有1 個,因此最直接破壞αβTCR 的方式就是靶向編碼TRAC 的基因。2011 年發表的一項研究支持了這一觀點，TCR α 亞基恒定基因發生突變會導致人類免疫缺陷病其特征是αβTCR 陽性T 細胞的缺失[6]。另一項開創性研究表明，通過ZFNs可以編輯基因消除內源性αβTCR 的表達，這些重新編程的T 細胞不僅表現出對CD19 的定向特異性，不響應TCR 刺激，而且保持了應有的抗腫瘤功能[7]。此外，TALENs 亦被證明，可在原代T 細胞中實現高效的基因編輯。例如，通過電穿孔技術將TALEN mRNA 轉入宿主細胞可獲得αβTCR 缺陷型T 細胞，從而消除了T 細胞與同種異體抗原的反應，并介導GvHD 的可能性[8]。同樣基于對TALENs 的應用，研究人員在制備用于治療難治性或復發性CD19 陽性的B 細胞白血病的UCART19 時，敲除了TCR α基因，旨在消除供體T 細胞引發GvHD 的可能性，同時敲除了CD52 基因可使供體T 細胞對淋巴瘤抑制劑阿侖單抗產生耐藥性[12]。出于安全性的考慮，UCART19 試驗中還進一步通過基因工程改造共表達的RQR8 基因。激活CAR-T 細胞上所攜帶的RQR8 安全開關，可允許在單次高劑量給藥利妥昔單抗時特異性清除異常擴增的CAR-T細胞[12]。另外，發表在Nature 上的一篇報道則突顯了CRISPR/Cas9 基因組編輯促進免疫治療的潛力[9]。研究發現，將針對CD19 特異性的CAR 導入TRAC基因座，不僅可以使T 細胞產生均勻的CAR 表達，而且還可以增強T 細胞的抗腫瘤療效[9]。進一步研究發現，將CAR 定位到TRAC基因座還可避免強直性CAR 信號轉導，并有效延緩效應T 細胞的分化和衰竭[9]。此外，megaTAL 核酸酶[10]和I-CreI 歸巢核酸內切酶[11]也被開發用于靶向清除內源性TCR 的表達。以上發現不僅揭示了破壞CAR-T 細胞內源性TRAC 表達的可行性，也突顯了基因組編輯TCR缺陷T 細胞以規避GvHD 的潛力。然而，需要指出的是，異體CAR-T 細胞在被敲除TCR基因后，仍然需要經歷TCR 負性篩選[13]。盡管目前的篩選效率較高，但依然無法保證極少量的TCR陽性細胞不產生GvHD。這也就意味著，當前臨床上應用同種異體CAR-T 細胞，仍然伴隨著治療細胞的數量與功效之間的權衡。

基因編輯正在徹底改變細胞免疫治療的可能性，但這也帶來了未知的風險。基因脫靶隨時可能發生，當多個位點被切斷時，新的易位可能發生。在UCART19 療法中，可以看到CD52 和TRAC基因座之間的重組[8]。

2 提高同種異體CAR-T 細胞的持久性

雖然上述有多種方法可以降低輸入到患者體內的異體CAR-T 細胞攻擊宿主的風險，但是同種異體CAR-T 療法還需要解決另一項重大挑戰，那就是患者的免疫系統會識別這些細胞是“外來”細胞，從而對它們產生免疫排斥反應。這種免疫排斥可能最終會將輸入患者體內的異體CAR-T細胞完全消滅。而由患者自身T 細胞介導的免疫反應可能在異體CAR-T 細胞療法輸入時就馬上開始工作，降低異體CAR-T 細胞療法的療效。因此，如何提高同種異體CAR-T 療法的持久性是這一領域亟待解決的問題。

2.1 淋巴細胞耗竭及其與基因編輯相結合的策略

一種增加異體CAR-T 細胞持久性的可能方案是，在不影響CAR-T 細胞活性的前提下延長淋巴細胞清除的持續時間。有研究顯示，將異體CAR-T 細胞轉移到淋巴細胞耗竭的人體后會經歷一個稱為穩態擴增的過程[15]。這一擴增是由諸如白細胞介素7（interleukin-7，IL-7）和IL-15在內的細胞因子以及暴露于靶標抗原所驅動[16]。因此，為確保CAR-T 細胞能發揮最大功效，在回輸之前，患者要先接受高劑量化療盡可能清除體內的原有淋巴細胞（lymphodepletion）以期在患者體內構建一個更有利于CAR-T 細胞生長的免疫環境[15]。一項研究表明，使用電穿孔技術將TALEN mRNA 轉入原代人T 細胞中進行高效的多重基因編輯。這種TALEN 介導的編輯方法可以使T 細胞同時缺失αβTCR 和CD52 蛋白的表達[12]。TCR 和CD52 缺陷的CD19 靶向型CAR-T 細胞可以在阿侖珠單抗清除體內淋巴細胞時穩態擴增[12]。在淋巴瘤原位小鼠模型中，UCART19 的抗腫瘤活性與標準的CD19 靶向性CAR-T 細胞相比沒有區別[8]；且UCART19 療法在臨床上的初步試驗也進一步支持了這一方案的可行性[17]。這項UCART19 療法治療高風險難治性或復發性B 細胞白血病患者試驗的初步結果顯示，UCART19 治療沒有帶來意外的毒性，且在CAR-T 細胞輸注后的第42 天依然可以在患者的血液中檢測到，證實其在人體內的持久擴增能力[17]。但是，在采用這一策略時患者體內的內源 細胞水平會被壓制到很低的水平，感染風險顯著提高。

2.2 通過基因編輯規避異源細胞的免疫原性

同種異體CAR-T 細胞的治療窗口取決于其初始擴增，持久性以及宿主免疫系統對它們的排斥程度。目前已有諸多研究人員對來自具有不同HLA 表達供體的T 細胞進行基因編輯，以逃避免疫應答。由于HLA-I 型蛋白（包括HLA-A、HLA-B 和HLA-C 等）是介導免疫排斥因素的關鍵分子，通過基因工程改造的方法敲除同種異體CAR-T 細胞表達HLA-I 型蛋白將最為直接。有研究針對HLA-A 進行了特定的ZFN 核酸酶設計，電轉編碼這些工程核酸酶的mRNA 選擇性破壞CD19 特異性T 細胞上HLA-A 的表達，最后成功對HLA-A 陰性T 細胞通過HLA 限制性細胞毒性T 細胞進行了富集[18]。

HLA 在細胞表面表達時需要β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）的亞基充當HLA-Ⅰ輕鏈，所以通過基因工程敲除B2M基因，也可以導致細胞表面缺乏功能性HLA-Ⅰ的表達。一項研究報告了新型B2M（－/－）人類胚胎干細胞（humanembryonic stem cells，hESCs）系的產生。從該系分化出的成熟T 細胞即使在干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的刺激下也不表達細胞表面HLA 分子，免疫原性遠低于正常hESCs[19]。此外，B2M（－/－）hESCs 品系不發生脫靶整合或切割事件，沒有穩定的B2M mRNA，并保留了自我更新能力，基因組穩定性和多能性[19]。使用CRIPSR-Cas9 系統，研究人員對T 細胞的內源性TRAC、B2M和程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）進行多重基因破壞，創建了可以抵抗PD-1 抑制的通用性CAR-T 細胞三聯基因編輯的CAR-T 細胞在臨床前的神經膠質瘤模型中顯示出顯著增強的抗腫瘤活性，且模型小鼠接受該CAR-T 細胞治療后，顯著延長存活時間[20]。

通過基因工程手段使T 細胞表面缺失HLA的表達，不可避免的就是對宿主自然殺傷（natural killer，NK）細胞的清除更加敏感。針對這個問題，已開發出相應的策略。研究人員使用腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）介導的基因編輯，使細胞表面表達HLA-E 單鏈二聚體（與B2M 融合）或三聚體（與B2M 和肽抗原融合），無細胞表面HLA-A、HLA-B 或HLA-C 表達的方式，在人類多能干細胞中的B2M基因座處插入HLA-E基因。這些經HLA 改造的多能干細胞及其分化衍生物將不被CD8＋T 細胞識別為同種異體，不結合抗HLA 抗體，并且對NK 細胞介導的清除具有抗性[21]。此外，還有研究人員通過CRISPR-Cas9 靶向破壞HLA-A 和HLA-B，但保留HLA-C 來增強誘導多能干細（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的免疫相容性，逃避CD8＋T 細胞和NK 細胞的殺傷作用[22]。

3 臨床前景

同種異體CAR-T 細胞的諸多優勢為治療復發性或難治性惡性腫瘤提供了更多可能性，尤其在疾病進展迅速的急性髓細胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）中有主要優勢。突破性的實例如，2例患有頑固性難治性CD19 陽性的B 細胞ALL 的嬰兒在接受單劑量UCART19 細胞（4.0～4.6×106個/kg）輸注后，均在28 d 內達到了分子緩解，并且該UCART19細胞在嬰兒體內一直持續存在，直到成功完成同種異體干細胞移植。這種移植前的過渡性策略證明了基因編輯技術的治療潛力。目前有多項同種異體CAR-T 細胞治療AML 和ALL 的臨床試驗正在開展，亦有試驗針對淋巴瘤、多發性骨髓瘤和實體瘤（表2）。所涉及的靶標與自體CAR-T治療的靶標相似，包括ALL 和B 細胞淋巴瘤中的CD19 和CD22；多發性骨髓瘤中的BCMA和CS1（也 稱CD319 和SLAMF7）；AML 中的CD123；T 細胞白血病和T 細胞淋巴瘤中的CD7 以及實體瘤中的NKG2D（natural killer group 2 member D）、CD70 和間皮素等。值得注意的是，對于AML 中的CD123 和多發性骨髓瘤中的CS1 等靶標，它們在腫瘤細胞上異質表達或在正常造血祖細胞上表達[23]，脫靶效應會是CAR-T 細胞不良反應的主要來源。但同時，由于同種異體CAR-T 細胞的持久性有限，對于靶點在正常細胞上表達，異源性CAR-T 細胞的較短的持久性可能會變得有利。此外，將不同特異性的異源CAR-T 細胞組合在一起，以消除腫瘤異質性的影響或避免初始靶標丟失的免疫逃逸，或許在將來會是一種有吸引力臨床治療策略。例如，在ALL 或B 細胞淋巴瘤中使用CD19 和CD22的CAR-T 細胞的組合[24]。近期，美國FDA 已經批準首個iPSCs 來源的同種異體CAR-T 細胞療法FT819 的新藥研究申請（Investigational New Drug），用于治療復發/難治性B 細胞惡性腫瘤，包括慢性淋巴細胞白血病、ALL 和非霍奇金淋巴瘤等。FT819 目前處于Ⅰ期研究階段，這是一種首創的、現成的、由iPSC 衍生的少TCR的CAR-T細胞療法，用于治療復發性/難治性B 細胞惡性腫瘤。iPSCs或將成為推進免疫細胞療法產業化的重要支柱。

表2 進入臨床開發階段的代表性通用型CAR-T 細胞產品Table 2 Representative universal CAR-T cells products entering the clinical development stage

對于面臨多重挑戰的實體瘤，一方面，腫瘤微環境中的物理屏障讓CAR-T 細胞難以浸潤到腫瘤內部；另一方面，即使CAR-T 細胞浸潤到了實體瘤內部，也面臨著腫瘤微環境的免疫抑制[25]。目前，已經有許多功能性模塊用于CAR-T 細胞的工程化改造，這些模塊包括改善T 細胞歸巢和運輸的C-C 基序趨化因子受體29（C-C motif chemikon receptor 29，CCR29）、CCR4 和CCR1[27-28]；改 善T 細胞增殖和持續性的細胞因子IL-12[29]、IL-18[30]、IL-15 和IL-21[31]分泌元件和細胞因子IL-7受體（IL-7 receptor，IL-7R）分泌[32]；對抗免疫抑制的顯性失活的（dominant-negative）受體[33]和開關受體[34]；局部呈遞免疫檢查點阻斷劑的元件[35]等。因此，目前有諸多策略來優化下一代CAR-T 細胞，使其具有更好的腫瘤選擇性、更好的腫瘤浸潤能力和在腫瘤微環境中對抗免疫抑制的能力。基因編輯技術允許在同種異體的CAR-T細胞中組合多種修飾，然而它們必須滿足嚴格的質量控制和監管認證流程，以應對可能的臨床風險。

4 展 望

CAR-T 細胞療法已經改變了某些血液系統惡性腫瘤的治療模式，并且是癌癥治療鄰域最有希望的療法之一。自體CAR-T 細胞治療正在集中闡述腫瘤不完全消除的機制，研究如何降低毒性，防止抗原逃逸以及基于已建立的合成生物學原理確定合適的靶標和策略，并將該方法擴展到其他惡性腫瘤。通用型CAR-T 細胞治療除了面臨著同樣的挑戰，還面臨著GvHD 和異體排斥這兩大難題。此外，同種異體CAR-T 細胞的簡化生產亦值得深入研究。例如直接生成超純現成同種異體 CAR-T 細胞a。但有理由相信，隨著基因編輯技術的發展，現貨型細胞治療將成為未來細胞療法領域的重要方向，有望為更多患者提供可獲得的治療途徑。