Xpert MTB/RIF與微量MIC快速檢測利福平異質性耐藥的分析

黃飛 陳俊林 瞿梅 顧德林 徐費凡 馬娟

控制耐多藥結核病是各國政府重點關注的衛生工作，近幾年WHO更是將單耐利福平(RFP)肺結核納入耐多藥結核病范疇[1]。如肺結核患者痰標本中結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)對RFP耐藥，則同時對異煙肼耐藥可能性明顯增加[2]，導致療效明顯降低、預后不良。如果能早期快速精準診斷耐RFP肺結核并即時調整治療方案，可避免無效用藥，同時在一定程度上避免低頻率、低耐藥MTB逐步演變成高頻率、耐多藥MTB，因此尋找到能快速精準檢測RFP耐藥MTB的藥敏技術非常重要。目前診斷RFP耐藥的金標準仍然為羅氏培養(L-J)及比例法藥敏技術、但需耗時2個月左右，不能滿足臨床需要； BACTEC MGIT960是能和比例法藥敏結果相媲美的自動化快速表型藥敏檢測技術[3-4]，但設備及試劑價格昂貴，無法推廣應用。隨著科技進步，一些新的能快速檢測RFP耐藥MTB的技術已在臨床得到應用，如篩查RFP耐藥的分子藥敏技術XpertMTB/RIF，雖然檢測結果和表型藥敏技術之間存在一定差異[5]，但檢測快速、僅需要幾小時就能自動篩查出標本中微量的MTB以及其rpoB基因是否發生突變[6-7]；微量MIC技術是近年來發展較為迅速的微量液體表型藥敏技術，目前應用效果和比例法藥敏技術相比仍然有一些不足[8-9]，但檢測速度快、成本低，應用前景非常好。為評估XpertMTB/RIF和微量MIC在快速精準檢測RFP耐藥MTB的臨床價值，本課題組將肺結核患者的涂陽痰標本作為檢測對象，以比例法藥敏作為對照標準，分別觀察Xpert MTB/RIF與微量MIC檢測效能，對產生異質性耐藥的可能原因進行分析，結果如下。

資料與方法

一、一般資料

1 標本來源

MTB標準株(H37Rv ATCC27294)購自國家菌種保藏中心，收集2016年8月～2020年2月在南通市第六人民醫院就診的466例肺結核患者的涂陽痰標本，其中男256例，女210例，年齡18～83歲，平均50歲。對每例肺結核患者均詳細記錄用藥史。痰抗酸桿菌菌量分級：按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[10]，以1+、2+、3+、4+記錄，其中94例標本1+、110例標本2+、136例標本3+、126例標本4+。

2 主要試劑和儀器

iddlebrook 7H9培養基干粉、OADC營養添加劑購自美國BD(Becton Dickinson)公司；RFP購自美國Fluka公司；GNP-92700隔水式培養箱購自上海精宏實驗設備有限公司；GeneXpert儀器及Xpert MTB/RIF檢測試劑盒購自美國Cepheid公司；對硝基苯甲酸(PNB)購自美國Sigma公司；24孔變色硅膠微孔板，由上海積彩醫療器械有限公司提供；微孔板檢測儀購自東樂自然基因生命科學公司；羅氏培養基及及7H9培養基由本實驗室自配。

二、方法

1 標本處理

取干酪樣或膿樣晨痰1mL于試管內，加入4mL 4%NaOH并進行振蕩使痰液充分消化，移入37 ℃水浴箱，15min后用1mmol/L的磷酸鹽緩沖液中和，以3000r/min轉速(1750g離心力)離心30min后移入37 ℃水浴電熱恒箱內。

2 L-J培養、菌型鑒定及比例法藥敏試驗

按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[10]中的標準化操作程序進行操作。質量控制：每次藥敏試驗均采用H37Rv標準株作為陽性參照。

3 XpertMTB/RIF核酸擴增檢測

按檢測說明書操作，系統自動進行檢測和結果判斷，2h內判斷標本內是否存在MTB以及是否存在rpoB基因突變。結果報告為：MTB檢出或未檢出，檢出菌量為高、中、低、極低；MTB檢出報告同步顯示rpoB基因突變的結果：△CT≥3.5，有基因突變；△Ct<3.5，無基因突變(Ct是指探針循環域值，△Ct指探針早期Ct值與晚期Ct值之差)，基因檢測探針分別以probe A、probeB、probeC、probeD、probeE命名。

4 微量MIC檢測涂陽標本中MTB對RFP藥物敏感性

微量MIC檢測工具，采用的是24孔變色硅膠微孔板作為MTB培養載體，參考文獻方法[11]，RFP藥敏的耐藥界值設定為1μg/mL。用二甲基甲酰胺溶解配制成10mg/mL，再用7H9培養基分別稀釋成所需濃度(0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/mL)；PNB用液體培養基稀釋，終濃度為800μg/mL。24孔微孔板中設定陽性對照孔、陰性對照孔、測試孔、PNB含藥孔。陽性對照孔加不含藥培養基0.4mL、接種0.4mL標本沉淀懸濁液；測試孔中分別加入不同終濃度0.4mL含RFP培養基，再接種0.4mL標本沉淀懸濁液；陰性對照孔加不含藥培養基0.8mL、不接種菌，作為陰性控制；PNB含藥孔加PNB稀釋液0.4mL及標本沉淀懸濁液0.4mL，用透明膠帶將培養板封好裝入密封袋，置于37 ℃溫箱培養。從培養第2天起，每天觀察微孔板底硅膠顏色是否由天藍色逐漸變黃色。若觀察期間內對照孔底硅膠顏色改變，PNB含藥孔底硅膠顏色改變，則說明標本中生長的細菌為非結核分枝桿菌；當測試孔底先于對照孔或與對照孔同時發生硅膠顏色改變，說明藥物不能抑制測試孔內MTB繁殖，判斷該測試孔內MTB對RFP耐藥；當陽性對照孔底硅膠顏色改變，測試孔尚未改變，說明測試孔MTB生長被藥物抑制，判為敏感。結果判斷時間為21天，超過21天不生長需重復試驗。質量控制：每次實驗均以H37Rv為敏感株質控，以牛分枝桿菌為耐藥株質控。

5 XpertMTB/RIF、微量MIC與比例法藥敏結果不一致的MTB臨床分離菌株進行基因擴增和rpoB基因測序，PCR產物純化和測序工作委托上海生工生物工程有限公司完成，PCR引物檢測序列涵蓋rpoB基因的第507至533位密碼子的核心區域，其引物堿基設計序列為5′-GGTCGCCGCGATCAAGGAGTT-3′，5′-TCTGATCGGCTCGCTGTCGGT-3′，擴增片段234bp。

三、統計學方法

結 果

一、三種藥敏方法檢測466例痰標本結果

L-J培養及比例法藥敏結果：培養報告為陰性34例、陽性432例，35例鑒定為非結核分枝桿菌、397例鑒定為MTB，其中77例痰標本中MTB對RFP耐藥。微量MIC檢測結果：培養報告陰性34例，陽性432例，35例鑒定為非結核分枝桿菌，397例鑒定為MTB，其中76例痰標本中MTB對RFP耐藥。Xpert MTB/RIF檢測結果：檢測到MTB 431例，其中94例MTB檢出rpoB基因發生突變。三種藥敏方法檢出的陽性例數、MTB檢出例數、耐藥檢出例數(%)(見表1)。

表1 三種藥敏方法檢出的陽性例數、MTB檢出例數、耐藥檢出例數[n(%)]

二、微量MIC藥敏結果分布情況

397例標本中MTB在RFP不同終濃度下藥敏結果：120株0.125μg/mL；129株0.25μg/mL；72株0.5μg/mL；10株1.0μg/mL；37株2.0μg/mL；18株4.0μg/mL；8株8.0μg/mL；3株16.0μg/mL(見表2)。

表2 397例標本中MTB在RFP不同終濃度下MIC分布情況(%)

三、Xpert MTB/RIF耐藥探針

檢測到基因突變標本94例，分別為probeA 8例、 probeB 5例、 probeC 8例、probeA+probeC 2例、probeD 33例、probE 37例、probeE +C 1例。probeA及probB檢測結果共13例，占13.8%。rpoB基因突變探針報告結果與菌量報告結果見表3。

四、L-J培養及比例法藥敏、微量MIC及Xpert MTB/RIF檢測結果比較

L-J培養及微量MIC兩種方法菌型鑒定結果完全一致，兩種藥敏方法同時檢出耐RFP的MTB 76株，以比例法藥敏為對照標準，微量MIC符合率為99.7%(396/397)，敏感性為100%(76/76)，特異性為99.7%(320/321)，兩種方法結果基本一致(Kappa=0.99)，差異無統計學意義(χ2=0.25,P>0.05)；L-J培養及比例法藥敏與Xpert MTB/RIF比較：12株Xpert MTB/RIF檢出rpoB基因突變而L-J培養陰性，12株Xpert MTB/RIF檢出rpoB基因突變而比例法藥敏報告為敏感，7株Xpert MTB/RIF檢測rpoB基因未發生突變而比例法藥敏報告為耐藥。以比例法藥敏為對照標準，Xpert MTB/RIF符合率為95.2(378/197)，敏感性為85.4%(70/82)，特異性為97.8%(76/76)，兩種方法結果一致性好(Kappa=0.85),差異無統計學意義(χ2=1.17、P>0.05)。三種方法檢測結果一致性與異質性比較見表4。比例法藥敏和微量MIC藥敏報告平均時間分別為52.5天和17.5天，差異有統計學意義(t=4.64，t>t(df)0.001、P<0.05)(見表5)。

表4 三種方法檢測結果一致性及異質性比較(以L-J培養及比例法藥敏為診斷標準)(n=397)

表5 比例法藥敏和微量MIC藥敏報告時間比較(單位：天)(n=397)

五、XpertMTB/RIF檢出rpoB基因突變與比例法藥敏異質性結果及既往用藥史情況(見表6)。

表6 XpertMTB/RIF檢出rpoB基因突變與比例法藥敏異質性結果

六、對L-J培養陽性，XpertMTB/RIF檢出rpoB基因突變、微量MIC與比例法藥敏結果不一致的MTB分離菌株進行測序。1株微量MIC與比例法藥敏結果不一致的MTB臨床分離菌株rpoB基因未發生突變；7株XpertMTB/RIF檢測rpoB基因未發生突變而比例法藥敏報告為耐藥的菌株，rpoB基因測序未見基因突變；12株XpertMTB/RIF檢出rpoB基因突變而比例法藥敏報告為敏感的菌株，rpoB基因測序可見基因突變，突變氨基酸位置：511位點突變7株：密碼子改變CTG→CCG、氨基酸改變Ser→Leu；516位點突變5株：密碼子改變GAC→GTC、氨基酸改變Asp→Gly(見表7)。

表7 XpertMTB/RIF檢出rpoB基因突變而比例法敏感的MTB臨床分離株基因測序結果

討 論

如能快速精準檢測到肺結核患者痰標本中RFP耐藥MTB，可及時調整治療方案，提高治愈率。L-J培養及比例法藥敏技術作為診斷RFP耐藥的金標準，雖然為各級結核病防治機構常規開展的檢驗方法、但因耗時過長不能滿足臨床需要。目前篩查RFP耐藥最快速最靈敏的藥敏技術首推Xpert MTB/RIF，該技術采用半巢式PCR，針對MTB的rpoB基因81bp耐藥決定區設計了5個分子信標探針，將MTB的DNA提取、PCR擴增和熒光檢測結合在一起，能快速檢測標本中微量MTB,并同時判斷rpoB基因是否發生突變，是目前檢測RFP耐藥MTB的最佳分子藥敏技術[13-15]。以比例法藥敏試驗結果為判斷標準，對本課題組400余例涂陽痰標本最終檢測結果分析，Xpert MTB/RIF檢測結果同比例法藥敏相比一致性較好(Kappa=0.85)，提示利用Xpert MTB/RIF快速檢測RFP耐藥MTB可靠性高、值得推廣應用。雖然兩種方法的檢測結果大多數一致，但小部分差異性結果，即異質性耐藥[16]，可能會影響臨床醫生的判斷并導致誤診誤治，給患者帶來不必要的身心損害。因此在積極利用Xpert MTB/RIF篩查RFP耐藥MTB同時，必須對出現異質性耐藥的原因進行認真分析。通過對本課題組中所有異質性耐藥MTB的rpoB基因測序的結果及患者的病史進行分析，筆者認為原因可能有以下幾方面：(一)部分肺結核患者在痰標本送檢前可能已接受了多種一線和二線抗結核藥物的治療，導致痰標本中MTB存在多種狀態：如活菌、死菌(DNA未降解)、L型MTB等[17]。而Xpert MTB/RIF是基于MTB的DNA提取、PCR擴增為基礎的基因檢測技術，對DNA未降解的各種狀態的MTB都能進行有效檢測，這就容易導致Xpert MTB/RIF檢測和L-J培養及比例法藥敏結果不一致，如本實驗組中利用XpertMTB/RIF檢測到12株菌株rpoB基因發生突變而L-J培養陰性菌株，結合其用藥史、考慮標本中MTB為死菌；(二)標本中敏感MTB為優勢菌群、同時存在低頻率RFP耐藥MTB，這時如果對標本處理不當[18]，可導致耐藥菌DNA不能被有效提取及PCR擴增。本組利用Xpert MTB/RIF檢測到1株rpoB基因無突變、但L-J培養陽性，且比例法藥敏提示RFP耐藥MTB，在培養基上僅見3個菌落生長，提示低頻率異質性耐藥菌容易被漏檢；(三)因抗結核藥物誘導刺激使MTB外排泵基因過表達或者發生突變、如類泛素蛋白-蛋白酶體系統中相關的Pup、Dop、PafA、Mpa等相關外排泵基因在RFP耐藥中作用已越來越得到重視[19]，可能出現比例法藥敏結果提示RFP耐藥但rpoB基因未發生突變[20-21]，本實驗中比例法藥敏結果提示6株RFP耐藥MTB但rpoB基因未發生突變，可能是MTB外排泵基因作用導致耐藥。(四)rpoB基因片段不同位點基因突變或者同一個位點不同氨基酸密碼子突變、可能導致耐藥程度不一致，即所謂低水平耐藥或者高水平耐藥[22]。Xpert MTB/RIF分子信標探針如probeA、probeB檢測區域相對應包含511、516位點基因，可能是低水平耐藥突變位點區域[23]，這一片段基因突變時，利用Xpert MTB/RIF和比例法藥敏試驗檢測可能會出現不一致結果，對本組中12株兩種藥敏結果不一致的MTB分離菌株、通過基因測序證明rpoB基因片段不同位點基因發生突變導致耐藥水平有明顯差異。XpertMTB/RIF雖然是篩查RFP耐藥的最快速最敏感檢測技術，但結果的精準性仍然值得進一步研究[24]。

確診RFP耐藥MTB及耐藥程度的高低，仍然要依賴表型藥敏檢測技術，而找到可替代比例法藥敏或者BACTEC MGIT960的快速表型藥敏檢測技術已成為研究熱點，本課題組關注的液體藥敏檢測技術，如微量MIC檢測快速、還可以觀察到MTB在各藥物終濃度下藥敏結果分布情況，能幫助臨床醫師快速精準選擇抗結核藥物，是最具有應用前景表型藥敏技術。目前臨床常用的微量MIC檢測工具是以普通的微孔板作為培養載體的，依靠肉眼觀察微孔板內是否出現白色菌體沉淀或形成特殊索狀結構來判斷藥敏結果，但易受結核菌菌量及毒力等因素影響結果判斷，所以實際應用效果和L-J培養及比例法藥敏仍然有一定差距[25]。本課題組選擇了最新研制的微量液體培養技術結合變色硅膠觀察技術(即可視化的微量MIC)作為普通微量MIC的升級版[26-27]，在實際應用中與L-J培養及比例法藥敏進行對照，結果顯示可視化的微量MIC法藥敏符合率、敏感性、及特異性大于99%，兩種檢測方法結果一致性非常好，可靠性優于普通微量MIC?？梢暬⒘縈IC藥敏平均報告時間為17.5天，與BACTEC MGIT960藥敏報告時間相似[11]，優于比例法藥敏平均報告時間52.5天。經過觀察技術改進，微量MIC完全可以成為檢測快速、成本低廉、高靈敏、高特異的表型藥敏技術，在臨床推廣應用。在L-J培養及比例法藥敏報告明顯滯后的情況下，如果能保證質控效果，可將微量MIC藥敏結果作為判斷標準。本組中出現1株微量MIC提示，對RFP敏感而比例法藥敏結果提示耐藥MTB，經過基因測序證明rpoB基因未發生突變，原因可能為標本中存在低頻率、以外排泵基因突變或者過表達為主的MTB耐藥菌，在微量MIC常規藥敏結果判斷期限內，因繁殖緩慢導致菌量過少不易被檢測到。

筆者認為在堅持L-J培養及比例法藥敏金標準前提下，既要充分利用好Xpert MTB/RIF和微量MIC的優秀檢測性能，也要關注并認真分析出現的小概率異質性耐藥事件。例如對既往用藥史長，效果不佳的絕大部分復治涂陽肺結核患者，如果痰標本中檢出probeC、probeD、probeE片段基因發生突變的MTB，即可判斷RFP高水平耐藥、需要及時調整治療方案，但對部分正在接受二線方案治療的患者，需要判斷送檢標本中MTB是否為死菌。對初治肺結核患者、如果痰標本中檢出probeA、probeB片段基因發生突變的MTB，可能為rpoB基因片段的低水平耐藥區域某位點發生基因突變，這時調整治療方案就需要謹慎，而同時進行微量MIC可快速有效檢測到不同RPF濃度下MTB的MIC[28]，彌補Xpert MTB/RIF檢測結果的不足，為制定合理方案提供依據[27]。