肺鱗癌中E2F1、E2F6及TPX2的表達及臨床意義

龐一雄 李萍 胡磊 胡琦 項安華 朱泉

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，非小細胞肺癌(non-small cell Lung carcinomas，NSCLC)占肺癌的80%，是肺癌的主要類型[1]。肺鱗癌是NSCLC主要病理亞型[1]，雖然生活條件和醫療水平有明顯改善，特別是手術切除，放療和化療等傳統治療有明顯進展，但是NSCLC患者早期臨床表現不典型，大部分到中、晚期才確診，而中晚期患者手術治療效果往往欠佳，所以5年生存率總體偏低[2-3]。除了傳統的治療方法外，肺癌分子靶向治療為我們提供了新的研究方向，尋找靶向治療肺鱗癌的特異性生物標志物是目前研究難點。E2F1、E2F6均為E2F轉錄因子家族的一員，在多種腫瘤疾病中均有報道，但國內有關E2F6的報道相對不多[4-5]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)是在細胞進行有絲分裂時紡錘體形成過程中發揮作用的一種微管相關蛋白，與小細胞肺癌發生有關[6]。目前，E2F1、E2F6、TPX2在肺鱗癌中的表達情況及與臨床病理關系較少有人研究。因此，本研究將通過檢測E2F1、E2F6、TPX2在肺鱗癌組織及癌旁組織中的表達情況，以期為進一步研究肺鱗癌治療、預后提供有價值的線索。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年2月至2020年10月于本院收治進行手術的肺鱗癌患者58例。取肺鱗癌患者手術中新鮮離體的肺鱗癌組織100 mg作為研究樣本，取癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm，且術后病理證實無癌細胞)50～100 mg作為對照樣本，手術樣本離體后均經液氮速凍，-80 ℃冰箱保存用于后續實驗。其中男39例，女19例，平均年齡53.89±7.85歲。TNM臨床分期標準以國際抗癌聯盟(Union for International Cancer Control，UICC)第8版為準，分為Ⅰ期11例、Ⅱ期14例、Ⅲ期20例、Ⅳ期13例。收集肺鱗癌患者一般資料，包括：年齡、性別、腫瘤直徑、淋巴轉移、臨床分期、腫瘤分化程度和吸煙史。

納入標準：(1)病理確診為肺鱗癌。(2)通過本院倫理委員會審核，符合相關倫理學規定。(3)所有研究對象及其家屬知情，并簽署知情同意書。

排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤、嚴重肝腎功能障礙、全身性感染、免疫系統疾病、精神疾病、嚴重代謝性疾病者。(2)術前接受過局部放療、全身化療、生物免疫治療、其他輔助治療或其他抗腫瘤治療者。(3)妊娠哺乳期女性。(4)資料不完整或不真實者。

二 、主要試劑

TRIzol試劑(貨號：GMS12279)購自深圳子科生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒(貨號：AB-4366596)購自上海嶸崴達實業有限公司；熒光定量PCR檢測試劑盒(貨號：KL190)購自上海康朗生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(型號：Prism?7500)購自美國應用生物系統公司；E2F1、E2F6、TPX2及GAPDH引物均由華大基因科技有限公司設計并合成，引物序列(見表1)。

表1 引物序列

三、 qRT-PCR法檢測肺鱗癌及癌旁正常組織中E2F1、E2F6和TPX2表達水平

1 RNA提取

使用TRIzol試劑提取總RNA。每份樣本取50～100 mg于勻漿器中，加液氮研磨成粉末狀，加入1 mL TRIzol試劑處理，轉移勻漿至無RNAase的Eppendof管中，4 ℃離心20 min后取上清，之后步驟均嚴格按照TRIzol試劑說明書進行操作。使用紫外分光光度計測定260、280 nm波長處的RNA樣本濃度及吸光度(A)值，當1.8

2 cDNA合成

將總RNA樣品逆轉錄成cDNA。20 μL體系：0.2 μg/μL RNA 2 μL，通用引物1 μL，5×buffer 4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL和逆轉錄酶1 μL，DEPC水補至20 μL，充分混勻，42 ℃水浴1 h，70 ℃水浴5 min，滅活反轉錄酶。檢驗合成的cDNA質量，合格后-80 ℃保存備用。

3 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)

采用qRT-PCR法檢測肺鱗癌及癌旁正常組織中E2F1、E2F6和TPX2表達水平。內參基因為GAPDH基因。10 μL反應體系：SYBR Green Mix 5 μL，50 ng/μL cDNA 1 μL，10 μM上游引物0.5 μL，10 μM下游引物0.5 μL和ddH2O 3.0 μL。反應條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 10 min；40個循環終止。qRT-PCR儀檢測E2F1、E2F6和TPX2的相對表達值，每個標本測3次，計算平均值，Ct值為擴增產物量達到臨界閾值時所對應的循環數，E2F1、E2F6和TPX2的相對表達值以2-ΔΔCt法表示。將E2F1、E2F6和TPX2的相對表達值由低到高排序，取中位數為界點，高于中位值為高表達，低于中位值為低表達。

四 、統計學分析

結 果

一 、E2F1、E2F6和TPX2在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達

與癌旁正常組織相比，肺鱗癌組織中E2F1、E2F6和TPX2表達水平均明顯上升(P<0.05)(見表2)。

表2 E2F1、E2F6和TPX2在肺鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達比較

二、 E2F1表達與肺鱗癌患者臨床病理特征的關系

58例肺鱗癌患者癌組織中E2F1表達情況分別為低表達27例，高表達31例。肺鱗癌組織中E2F1表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、臨床分期、吸煙史無關(P>0.05)，與淋巴轉移、腫瘤分化程度有關(P<0.05)(見表3)。

表3 E2F1表達與肺鱗癌臨床病理特征的關系(n)

三、 E2F6表達與肺鱗癌患者臨床病理特征的關系

58例肺鱗癌患者癌組織中E2F6表達情況分別為低表達25例，高表達33例。肺鱗癌組織中E2F6表達與患者年齡、性別、吸煙史無關(P>0.05)，與腫瘤直徑、淋巴轉移、臨床分期、腫瘤分化程度有關(P<0.05)(見表4)。

表4 E2F6表達與肺鱗癌患者臨床病理特征的關系(n)

四、TPX2表達與肺鱗癌患者臨床病理特征的關系

58例肺鱗癌患者癌組織中TPX2表達情況分別為低表達21例，高表達37例。肺鱗癌組織中TPX2表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、吸煙史無關(P>0.05)，與淋巴轉移、臨床分期、腫瘤分化程度有關(P<0.05)(見表5)。

表5 TPX2表達與肺鱗癌患者臨床病理特征的關系(n)

五、肺鱗癌組織中E2F1、E2F6和TPX2表達的相關性

相關性分析結果顯示，肺鱗癌組織中E2F1和E2F6表達呈明顯正相關(r=0.455，P<0.05)，TPX2和E2F1表達呈明顯正相關(r=0.471，P<0.05)，TPX2和E2F6表達呈明顯正相關(r=0.508，P<0.05)(見圖1、2、3)。

圖2 肺鱗癌組織中TPX2和E2F1表達的相關性分析

討 論

肺癌是臨床上危害人類健康最常見的呼吸系統惡性腫瘤之一。 中國國家癌癥中心登記數據分析結果顯示，2015年新發肺癌人數約為78.7萬例，發病率高達57.26/10萬，每年因肺癌死亡人數約為63.1萬例，死亡率為45.87/10萬。 肺癌導致惡性腫瘤疾病負擔日趨嚴重，成為我國惡性腫瘤死亡主要病因[7]。肺鱗癌是肺癌中常見的病理類型，與肺腺癌相比，其發病機制的研究和治療進展滯后[1,8]。由于特異性靶向治療肺鱗癌的藥物相對缺乏，患者預后結果差，5年生存率低于15%，即使進行了肺切除術，復發率、轉移率仍處于較高水平[9]。雖然肺鱗癌早期臨床表現不典型，但臨床表現通常與腫瘤發生位置、病理類型、病情程度密切相關，所以，尋找與肺鱗癌臨床病理有關、可能對治療肺鱗癌有效的潛在靶基因，具有重要的臨床價值。

圖3 肺鱗癌組織中TPX2和E2F6表達的相關性分析

E2F1、E2F6均為E2F家族的重要成員，據報道，E2F家族是重要的轉錄因子家族，在細胞周期進展、DNA復制、DNA修復、細胞分化、增殖與凋亡等細胞過程中起調控作用[10-11]。Sun等[12]分析E2F1在肺癌患者中表達發現，肺鱗癌、肺腺癌組織中E2F1 mRNA和蛋白水平均高于正常肺組織。Wang等[13]分析發現，E2F1可以通過調控促進小細胞肺癌的上皮間質轉化過程，參與小細胞肺癌的侵襲、轉移。曹燕飛等[14]研究發現，E2F6參與肺鱗癌細胞的增殖與侵襲，通過上調miR-185，可靶向抑制E2F6蛋白表達，肺鱗癌細胞的增殖、侵襲能力亦隨之受抑制。Zheng等[15]研究結果表明，E2F6在子宮內膜癌組織中表達上調，在低分化組織中表達高于高分化組織，在高遷移能力細胞系中表達高于低遷移能力細胞系，miR-424可通過抑制E2F6表達參與子宮內膜癌中細胞侵襲、遷移和轉移，發揮抑癌基因的作用。本研究中，肺鱗癌組織中E2F1、E2F6表達水平較癌旁組織均明顯上升，提示E2F1、E2F6可能在肺鱗癌中發揮作用。分析肺鱗癌組織中E2F1、E2F6表達水平與臨床病理特征的關系，發現肺鱗癌組織E2F1表達與淋巴轉移、腫瘤分化程度有關，肺鱗癌組織E2F6表達與腫瘤直徑、淋巴轉移、臨床分期、腫瘤分化程度有關，且腫瘤低分化程度中E2F6高表達比例更高，這與Zheng等[15]在子宮內膜癌中的研究一致，提示E2F1表達可能與細胞侵襲、分化有關，E2F6表達可能與細胞增殖、侵襲和分化有關。

TPX2表達受細胞周期調控，在有絲分裂期與紡錘體結合時，通過將TPX2靶向附著于紡錘體微管，保證正常的紡錘體極性，其過表達可能會抑制正常的核分裂，干擾其自身激活的生理途徑，在癌變、惡性腫瘤進展中發揮作用[16-17]。葉靜梅等[6]研究發現，TPX2在小細胞肺癌組織中高表達，可能與小細胞肺癌的發生發展、遠處轉移有關。本研究結果顯示，TPX2在肺鱗癌組織中表達上調，與淋巴轉移、臨床分期、腫瘤分化程度有關，提示TPX2可能在肺鱗癌發生中發揮作用，可能與肺鱗癌細胞侵襲、分化有關。肺鱗癌組織中E2F1、E2F6、TPX2表達均呈正相關，提示E2F1、E2F6、TPX2間表達聯系密切，可能共同參與肺鱗癌發生發展，但具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，肺鱗癌組織中E2F1、E2F6、TPX2表達均明顯上調，且相互呈正相關，均與淋巴轉移、腫瘤分化程度有關，可能均參與肺鱗癌細胞侵襲、分化。但由于本研究納入樣本量較少，結果可能具有局限性，下一步將繼續收集樣本，對E2F1、E2F6、TPX2在肺鱗癌中的作用進一步深入研究，以期為肺鱗癌臨床治療、預后提供更有價值的理論參考。