非小細(xì)胞肺癌患者中Th17細(xì)胞及IL-17變化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后的相關(guān)性分析

左秀萍 高苗 宋娟 徐夢 張朋勃 張勇 吳蓉

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，其發(fā)病率正逐年攀升[1]，并趨于年輕化方向發(fā)展，現(xiàn)已成為城市腫瘤發(fā)病率和死亡率第一位的惡性腫瘤疾病。據(jù)相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的80%[2]，且極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者生存期縮短。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是常見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之一，在早期可毫無癥狀，在查體時會發(fā)現(xiàn)鎖骨上區(qū)淋巴結(jié)固定、堅硬，可融合，但無痛感，不易引起患者重視，從而導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)時多進(jìn)展至晚期，預(yù)后極差。促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的重要原因之一是機(jī)體免疫水平降低，而近年來研究結(jié)果顯示[3]，Th17細(xì)胞和IL-17在腫瘤免疫、感染免疫、自身免疫性疾病中均發(fā)揮著重要作用。本文旨在探究NSCLC患者中Th17細(xì)胞及IL-17變化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后的相關(guān)性，為此筆者展開臨床對照性研究，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取2017年1月到2018年12月我院收治的NSCLC患者200例，設(shè)為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：① 符合世界衛(wèi)生組織(WHO)中NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診；② 無合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病者；③ 未接受任何放療、化療、免疫治療等綜合治療；④ 觸診、CT檢查和B超檢查結(jié)果均顯示淋巴結(jié)腫大，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，判定為淋巴結(jié)陽性；⑤ 自愿參與該研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床資料不全者；② 患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等自身免疫疾病；患有慢阻肺、支氣管哮喘等急慢性感染。研究組男144例、女56例；年齡52歲～85歲，平均年齡(67.03±5.24)歲；疾病分型：腺癌91例、鱗狀細(xì)胞癌109例；腫瘤分期：Ⅰ期39例、Ⅱ期58例、Ⅲ期47例、Ⅳ期56例。依據(jù)納入對象淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，將研究組中112例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者設(shè)為轉(zhuǎn)移組，將88例未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者設(shè)為未轉(zhuǎn)移組。其中，轉(zhuǎn)移組男83例，女29例；年齡52歲～85歲，平均年齡(67.14±4.85)歲；疾病分型：腺癌48例，鱗狀細(xì)胞癌64例；腫瘤分期：Ⅰ期21例、Ⅱ期34例、Ⅲ期24例、Ⅳ期33例。未轉(zhuǎn)移組男61例、女27例；年齡55歲～82歲，平均年齡(66.85±5.32)歲；疾病分型：腺癌43例、鱗狀細(xì)胞癌45例；腫瘤分期：Ⅰ期18例、Ⅱ期24例、Ⅲ期23例、Ⅳ期23例。選取同期健康體檢者100例，設(shè)為對照組，男73例、女27例；年齡67歲～83歲，平均年齡(66.76±3.96)歲。三組患者基線資料比較無顯著差異(P>0.05)，具可比性(見表1)。

表1 三組患者一般資料比較

二、方法

試劑：蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑Brefeldin(BFA)、Fixation/pormeabilization破膜劑、單克隆抗體：鼠抗人APC-IL17、鼠抗人PerCP-CD3、鼠抗人PE-Cy7-CD4，購于美國Becton Dickinson公司。離子霉素、刺激劑波酯(PMA)，購于美國Sigma公司。人外周血淋巴細(xì)胞分離液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液、人IL-17酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒，購于聯(lián)科生物科技有限公司。

儀器：流式細(xì)胞儀(BD FACSAria)，購于美國Becton Dickinson公司；酶標(biāo)儀(Elx800)，購于美國BioTek公司；離心機(jī)(F2-MC型)，購于美國Beckmman公司；生物安全柜(BSC-1304 ⅡA2)，購于 南京貝登醫(yī)療股份有限公司；培養(yǎng)箱(Binder CB 060)，購于北京創(chuàng)誠致佳科技有限公司。

流式細(xì)胞檢測：使用肝素鈉抗凝采血管采集納入對象患者空腹外周靜脈血5mL，使用加樣槍吸取250μL全血按照1 ∶3比例與750μL胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液混勻，再依次加入BFA 10μL/mL，離子霉素1μL/mL和PMA 100ng/mL。上述試劑加入完成后充分混勻，放入5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h。收集培養(yǎng)好的細(xì)胞至流式管中，1500r/min速率離心5min，棄去上清液，留下沉淀細(xì)胞待用。向流式管中加入細(xì)胞表面染色熒光抗體PerCP-CD3和PE-Cy7-CD4各10μL，室溫避光反應(yīng)15min。加入BD溶血素2mL以溶解紅細(xì)胞，室溫培養(yǎng)10min。1500r/min速率離心5min，棄去上清液，留下沉淀。加入Fixation/pormeabilization破膜劑1mL，室溫培養(yǎng)20min。加入PBS洗液2mL，1500r/min速率離心5min，棄去上清液，留下沉淀。加入10μL熒光標(biāo)記的APC-IL17進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，避光反應(yīng)30min。加入PBS洗液3mL，1500r/min速率離心5min，棄去上清液，留下沉淀。重復(fù)上述操作兩次。加入300μL PBS洗液上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

ELISA檢測：從4 ℃冰箱中取出凍干標(biāo)準(zhǔn)品，平衡至室溫。加入相應(yīng)比例稀釋液后上下顛倒混勻，并靜置15min以充分溶解凍干標(biāo)準(zhǔn)品，使用前再次混勻。配置不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，然后將標(biāo)本和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)板孔，加入相應(yīng)的生物標(biāo)記素進(jìn)行標(biāo)記，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，置于37 ℃孵育60 min。清洗液洗板4次，拍干洗液。加入生物素化抗體工作液進(jìn)行反應(yīng)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育60 min。清洗液洗板4次，拍干洗液。加入酶結(jié)合物工作液進(jìn)行反應(yīng)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37 ℃孵育30min。清洗液洗板4次，拍干洗液。加入顯色劑，37 ℃避光顯色20min。加入終止液，微型振蕩器上震蕩混勻，并立即上機(jī)測試。上述所有操作均應(yīng)按照IL-17 ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

對NSCLC患者進(jìn)行為期1年的隨訪記錄，了解其預(yù)后情況(存活、死亡)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析，兩組定量數(shù)據(jù)比較采用t檢驗,多組定量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析的方法,多組之間兩兩比較采用SNK-Q 檢驗的方法，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]表示，比較采用Mann-WhitneyU檢驗。定性數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、三組Th17細(xì)胞、IL-17水平比較

三組間Th17細(xì)胞和IL-17水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且轉(zhuǎn)移組Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于對照組(P<0.05)，未轉(zhuǎn)移組Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于對照組(P<0.05)，轉(zhuǎn)移組Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于未轉(zhuǎn)移組(P<0.05)(見圖1和圖2)。

圖1 Th17細(xì)胞水平 圖2 IL-17水平

二、NSCLC患者不同病理特征的Th17細(xì)胞和IL-17水平比較

外周血中Th17細(xì)胞和IL-17水平與NSCLC患者分化程度、病理分型、TNM分期密切相關(guān)，鱗狀細(xì)胞癌患者Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于腺癌(P<0.05)，低分化程度患者Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于中分化和高分化(P<0.05)，Ⅳ期Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期(P<0.05)，且分化程度越低、TNM分期越高，Th17細(xì)胞和IL-17水平越高(見表2)。

表2 NSCLC患者不同病理特征的Th17細(xì)胞和IL-17水平比較

三、NSCLC患者不同預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的Th17細(xì)胞和IL-17水平比較

對納入研究NSCLC患者進(jìn)行為期1年的隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有56例患者死亡，144例存活。死亡患者Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于存活患者(P<0.05)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Th17細(xì)胞和IL-17水平明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)(見表3)。

表3 NSCLC患者不同預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的Th17細(xì)胞和IL-17水平比較

四、相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析顯示，Th17淋巴細(xì)胞與患者預(yù)后死亡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的點二列相關(guān)系數(shù)顯著(rs=0.594，P<0.05；rs=0.646，P<0.05)，提示IL-17水平越高，越傾向于預(yù)后死亡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，IL-17水平與患者預(yù)后死亡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的點二列相關(guān)系數(shù)顯著(rs=0.473，P<0.05；rs=0.538，P<0.05)，提示IL-17水平越高，越傾向于預(yù)后死亡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

討 論

臨床研究結(jié)果顯示[5]，NSCLC患者極易發(fā)生腦、骨、腹腔以及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且早期癥狀具有一定隱匿性，大部分患者確診時已錯過最佳治療時間進(jìn)展至晚期，導(dǎo)致疾病預(yù)后差、5年生存率甚至不足15%。手術(shù)、放化療、靶向治療等綜合治療是臨床治療NSCLC的主流方法[6]，對存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者而言，上述治療手段均難以取得較為滿意的臨床治療效果，究其原因與患者自身免疫功能低下密切相關(guān)。有研究表明[7]，腫瘤免疫微環(huán)境中細(xì)胞因子和肺腫瘤細(xì)胞的相互作用可促進(jìn)微血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

在機(jī)體遭受腫瘤細(xì)胞侵犯時，人體免疫系統(tǒng)中自然殺傷細(xì)胞(NK)、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等細(xì)胞可發(fā)揮抗腫瘤機(jī)制效應(yīng)。臨床研究證實[8-9]，在不同細(xì)胞因子作用下初始CD4+T淋巴細(xì)胞可分化為具備不同功能的T細(xì)胞亞群，最為常見的有Treg、Th1、Th2。Th17淋巴細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞新亞群，主要分泌細(xì)胞因子是促炎因子IL-17，具有獨立分化及調(diào)節(jié)機(jī)制。既往研究結(jié)果顯示[10-12]，Th17淋巴細(xì)胞與多種炎癥性病變、機(jī)體防御反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤疾病的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)。有研究顯示[13-14]，在胃癌、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤患者外周血中均可檢測到IL-17高度表達(dá)和Th17淋巴細(xì)胞浸潤。

目前，IL-17和Th17淋巴細(xì)胞在NSCLC患者腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境中的作用機(jī)制是促進(jìn)或拮抗尚未有統(tǒng)一的定論，但大部分研究結(jié)果顯示Th17淋巴細(xì)胞可參與腫瘤免疫分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤效應(yīng)機(jī)制[15-16]。動物實驗表明[17]，IL-17淋巴細(xì)胞在裸鼠內(nèi)可招募巨噬細(xì)胞到腫瘤部位，促進(jìn)人類宮頸癌的生長。人類肝細(xì)胞肝癌研究顯示[18]，IL-17淋巴細(xì)胞腫瘤浸潤可促進(jìn)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤生長。多發(fā)性骨髓瘤患者Th17細(xì)胞和IL-17水平升高，并抑制效應(yīng)免疫功能。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者外周血中IL-17表達(dá)水平和Th17淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于正常對照，存在淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者IL-17水平和Th17淋巴細(xì)胞數(shù)量高于無淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者，除此之外，Th17淋巴細(xì)胞和IL-17水平與患者病理分型、分化程度、TNM分期密切相關(guān)，分化程度越低、TNM分期越高，Th17細(xì)胞和IL-17水平越高。提示IL-17和Th17淋巴細(xì)胞可在NSCLC患者中高度表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者病理分型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。與此同時，亦有部分學(xué)者認(rèn)為Th17淋巴細(xì)胞可在腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。其作用機(jī)制主要有[19-20]：①Th17淋巴細(xì)胞能直接根除腫瘤細(xì)胞；②間接抗腫瘤效應(yīng)：增強(qiáng)腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)或招募其他腫瘤特異性免疫細(xì)胞聚集，啟動強(qiáng)大抗腫瘤CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。但由于支持Th17淋巴細(xì)胞具有抗腫瘤效應(yīng)的證據(jù)均來自動物實驗，并不能說明人體內(nèi)亦存在相同作用機(jī)制。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能夠讓腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散到全身各處，加快疾病的進(jìn)展，是導(dǎo)致不良預(yù)后的重要原因。本研究對患者IL-17水平和Th17淋巴細(xì)胞數(shù)量與患者預(yù)后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作了進(jìn)一步探究。Pearson相關(guān)分析顯示，患者IL-17水平和Th17淋巴細(xì)胞數(shù)量與患者預(yù)后死亡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的點二列相關(guān)系數(shù)顯著，這可能與IL-17和Th17淋巴細(xì)胞能夠促進(jìn)腫瘤微血管生成，加快疾病進(jìn)程有關(guān)，可作為臨床預(yù)后不良指標(biāo)。

綜上所述，Th17細(xì)胞和IL-17在NSCLC患者中呈高表達(dá)狀態(tài)，與患者預(yù)后 和淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性，探討其在淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制對NSCLC疾病的診斷和免疫治療具有重要意義。