microRNA-15b通過調節MET-PI3K-Akt通路對肺癌模型鼠免疫功能及高凝狀態的影響研究

陳超 常娜 趙萌 張蕊 張瑩

肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，肺癌的總體5年生存率僅為15%[1]。免疫抑制在腫瘤的發生和進展中起著重要的作用，腫瘤會影響機體T淋巴細胞亞群，抑制細胞免疫[2]。此外，肺癌患者往往處于高凝狀態，這會增加肺栓塞的發生風險并影響預后[3]。MET-PI3K-Akt通路在肺癌患者中高表達，不但參與肺癌細胞的增殖、轉移和免疫抑制，還與凝血有關，研究顯示PI3K-Akt通路的激活會誘導高凝狀態[4-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)可在轉錄后水平上調節基因的表達參與肺癌進程，最近的臨床研究顯示miR-15b在肺癌患者血清中降低，并可以促進肺癌細胞凋亡，但是其作用機制尚不明確[6]。并且最新研究顯示抑制miR-15b可以通過激活PI3K/AKT相關通路促進氧葡萄糖剝奪心肌細胞模型的存活[7]。綜上，本文主要分析miR-15b通過調節MET-PI3K-Akt通路對肺癌模型鼠免疫功能及高凝狀態的影響，并探究其作用機制。

材料與方法

一、主要實驗材料

人肺癌細胞A549(ATCC公司，美國)。DMEM培養基血清和抗體(Invitrogen公司，美國)。BALB/C裸鼠(上海斯萊克實驗動物中心，中國)。miR-15b類似物(mimic)、抑制劑(inhibitor)以及陰性對照(negative control，NC)(GenePharma公司，China)。LipofectamineTM 2000(Invitrogen，美國)。ELISA試劑盒和TUNEL染色試劑盒。TRIzol(Sigma公司，美國)。miScript試劑盒和PrimeScript-RT(Takara公司，日本)。anti-CyclinD1、anti-Ki67、anti-MET、anti-PI3K、anti-AKT(Abcam公司，美國)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)。ECL 顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)。FACSCanto II流式細胞儀和配套試劑盒(BD Biosciences公司，加拿大)。miR-15b類似物(mimic)和陰性對照(NC)(GenePharma公司，China)。LipofectamineTM 2000(Invitrogen，美國)。pMIR-REPORT 雙熒光素酶試劑盒和1000 Assay System檢測系統(Thermo Fisher公司，美國)。

二、分組和建模

將DMEM培養基中處于對數生長期的各組等的A549細胞分為3組：NC組、mimic組和inhibitor組，mimic組和inhibitor組分別通過Lipofectamine 2000轉染50 nM 的miR-15b mimic或者inhibitor來上調或抑制miR-15b的水平。NC組轉染等量的NC空載質粒作為對照組，轉染條件為7 ℃，5%CO2，48 h。通過qPCR分析轉染效果。將轉然后的各組細胞重新配置成濃度為5×105個/mL的溶液，然后將0.2 mL的細胞懸液注射在小鼠右前腋下，每組細胞10只小鼠，在7 d時可以觸摸到有瘤體生成提示建模成功，在第28 d ，將小鼠稱重后，取眼眶血，然后斷頭處死小鼠，收集腫瘤病灶。

三、檢測指標和方法

1 RT-qPCR檢測miR-15b

腫瘤組織中總RNA通過TRIzol獲得，通過miScript試劑盒合成互補DNA(7 ℃/60分鐘，95 ℃/5分鐘，4 ℃)，利用MiScript SYBR-Green PCR試劑盒檢測互補DNA(95 ℃/10 s，55 ℃/30 s，72 ℃/30 s，40個循環)。U6用作miR-15b的內源參照，通過2-ΔΔCq分析RNA的相對表達水平。

2 TUNEL染色檢測凋亡

將腫瘤組織用4%的聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標本，將樣本脫蠟、抗原修復處理，并用密封液封閉。在切片中加入50 μL 的TUNEL反應溶液，在37 ℃下孵育1 h，然后用使用PBST洗滌切片。然后加入100 μL的二氨基聯苯胺在37 ℃下孵育30 min，然后用PBST洗滌。最后，在顯微鏡下觀察樣品。隨機選擇每個組織的四個視野進行計算，凋亡指數=凋亡數/(凋亡數+正常細胞數)×100%。

3 Western blot檢測增殖蛋白Cyclin D1和Ki67

將腫瘤組織研磨后收集總蛋白并通過BCA試劑盒檢測濃度。應用SDS-PAGE(110 V，100分鐘)分離40μg的總蛋白。分離后，將蛋白質轉移到PVDF膜上，并在膜上添加1 ∶500稀釋的anti-CyclinD1、anti-Ki67抗體并孵育過夜。然后在室溫下加入以1 ∶5 000稀釋的HRP標記的二抗，4 ℃下孵育2 h。 通過ECL檢測蛋白印跡帶。GAPDH作為內參。

4 凝血功能和內皮功能

一部分新鮮的小鼠血液樣本送至檢驗科檢測全血黏度，并以及血漿凝血酶原時間(PT)及活化部分凝血活酶時間(APTT)。ELISA檢測血清內皮功能指標，然后將血液樣本在2000 rps下離心20 min收集血清，通過ELISA說明書加入試劑，顯色后使用酶標儀在450 nm下檢測吸光度(OD)，根據標準曲線計算一氧化氮(NO)和內皮素(ET1)的濃度。

5 流式細胞術檢測CD4+和CD8+細胞

使用流式細胞術檢測小鼠外周血中CD4+和CD8+水平，按照試劑盒加入抗體孵育對標志蛋白進行標記，通過流式細胞儀檢測CD4+和CD8+水平。

6 Western blot檢測MET-PI3K-Akt通路

根據1.3.1的方法檢測腫瘤組織中MET、PI3K、Akt蛋白水平。

7 雙熒光素酶報告

根據工具網站Starbase預測miR-15b與MET mRNA的的結合位點，根據結合部分的序列分別構建野生型(wt-)和突變型的(mut-)的MET序列和miR-15b mimic或NC序列克隆到pMIR-REPORT熒光素酶載體中。使用Lipofectamine 2000將細胞用兩種載體轉染至細胞中。使用雙熒光素酶報告基因1000 Assay System分析系統評估熒光素酶活性。當miR-15b與MET結合后，熒光素酶活性會降低。然后通過RT-qPCR和Western blot檢測NC組和mimic組中MET mRNA和蛋白水平。

四、統計學處理

統計分析使用SPSS 19軟件。以平均值±標準差(SD)表示，兩組定量數據的比較采用t檢驗的方法;多組定量數據地比較采用ANOVA方差分析，兩兩比較通過SNK-q。 統計學顯著性表示為P<0.05。

結 果

一、miR-15b對腫瘤生長的影響

與NC組比較，mimic組的miR-15b水平(3.45±0.36)顯著升高而inhibitor組(0.52±0.07)顯著降低(P<0.05)。并且mimic組的腫瘤體積、質量顯著低于NC組而inhibitor組顯高于NC組 (P<0.05)(見表1)。

表1 各組miR-15b以及腫瘤體積、質量比較(n=10)

二、miR-15b對腫瘤細胞凋亡的影響

如圖1，深棕色為凋亡細胞，NC組的凋亡指數為(5.12±0.46)%，mimic組的凋亡指數(17.72±3.57)%顯著高于NC組(P<0.05)，inhibitor組的凋亡指數(1.35±0.41)%顯著低于NC組(P<0.05)(見圖1)。

圖1 TUNEL染色檢測腫瘤細胞凋亡情況(×400)表3 各組血液流變學指標比較(n=10)

三、miR-15b對腫瘤細胞增殖的影響

與NC組(1.12±0.19，1.35±0.10)比較，mimic組的增殖相關蛋白CyclinD1和Ki67蛋白水平(0.52±0.05，0.48±0.04)明顯降低而inhibitor組的上述水平(2.67±0.24，2.55±0.26)明顯升高(P<0.05)(見表2、圖2)。

圖2 Western blot檢測腫瘤中CyclinD1和Ki67蛋白水平

表2 各組腫瘤組織中CyclinD1和Ki67蛋白水平比較(n=10)

組別低切(5·s-1)中切(30·s-1)高切(200·s-1)PT(s)APTT(s)NC組8.42±1.046.71±0.744.65±0.4317.52±0.7221.47±1.27mimic組10.91±1.23a8.39±0.91a5.38±0.57a15.21±0.86a18.67±1.39ainhibitor組7.06±1.08a6.12±0.83a4.06±0.53a19.78±1.15a24.05±1.45aF26.89728.95020.44324.72431.859P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

四、miR-15b對血液流變學指標的影響

mimic組的全血黏度高于NC組而PT和APTT顯著低于NC組(P<0.05)，inhibitor組的全血黏度低于NC組而PT和APTT顯著高于NC組(P<0.05)(見表3)。

五、miR-15b對內皮功能的影響

與NC組比較，mimic組的NO升高而ET1降低(P<0.05)，inhibitor組的NO降低而ET1升高(P<0.05)(見表4)。

表4 各組NO和ET1水平比較(n=10)

六、miR-15b對肺癌模型小鼠免疫功能的影響

mimic組的CD4+(19.83±2.71%)和CD4+/CD8+水平(1.30±0.34)顯著高于NC組(16.74±2.67%，1.07±0.24)(P<0.05)，而inhibitor組的CD4+(11.32±2.62%)和CD4+/CD8+水平(0.77±0.18)顯著低于NC組(P<0.05)(見表5)。

表5 各組CD4+和CD8+水平比較(n=10)

七、miR-15b對肺癌模型小鼠MET-PI3K-Akt通路的影響

mimic組MET、PI3K、Akt水平顯著高于NC組而inhibitor組上述指標水平顯著低于NC組(P<0.05)(見表6、圖3)。

圖3 Western blot檢測腫瘤中MET、PI3K、Akt水蛋白水平

表6 各組MET、PI3K、Akt水平比較(n=10)

八、雙熒光素酶報告驗證miR-15b靶向抑制MET

miR-15b與MET mRNA結合位點(如圖4)所示。根據雙熒光素酶報告，同時轉染miR-15b mimic和wt-MET時，相對熒光酶素活性顯著降低(P<0.05)，提示miR-15b與MET mRNA靶向結合(如表7)。并且mimic組的MET mRNA和蛋白水平顯著低于NC組(見表8)。

表7 雙熒光素酶報告檢測靶向結合

表8 過表達miR-15b對MET mRNA和蛋白表達水平的影響

圖4 miR-15b與MET mRNA結合位點

討 論

肺癌是最致命的惡性腫瘤，最新的統計報告估計，肺癌約占所有女性癌癥死亡患者的26%和所有男性癌癥死亡患者的29%[8]。主動或被動吸煙、輻射、煙塵、職業性接觸石棉、鎳、鉻和砷等物質均是肺癌的誘發因素。雖然診斷和治療肺癌的新方法被不斷應用于臨床，但由于確診時約有35%的肺癌病例已經處于晚期，肺癌的預后仍不令人滿意。

近年來，miRNA在肺癌中的作用被廣泛的發現，miRNA可通過堿基配對的方式與mRNA結合，從而在轉錄后水平上調控基因的表達。miR-15b是近年來新發現的一種與腫瘤有關的miRNA，研究已經發現在宮頸癌、舌癌以及胃癌中起到抑制腫瘤的作用[9-11]。在肺癌中，研究發現miR-15b可以通過抑制Bcl2蛋白的表達誘導凋亡發揮抑癌作用[12]。也有臨床研究結果發現了血清中的miR-15b可以作為肺癌的標志因子[13]。本文通過體內實驗，分析提高或抑制miR-15b對肺癌裸鼠模型的的影響，結果顯示提高miR-15b的水平可以抑制肺癌裸鼠模型中腫瘤細胞的增殖并誘導凋亡，抑制腫瘤的生長，而抑制miR-15b對肺癌產生促癌作用。本次研究通過體內實驗證實了miR-15b在肺癌中發揮抑癌作用。

免疫抑制是腫瘤的主要特征之一，在這個過程中，機體的免疫系統受到抑制，CD4+比例顯著降低，CD4+/CD8+的比例也下降[14]。并且CD4+/CD8+受到抑制也是腫瘤發生、進展、轉移的必要條件[15]。此外對于肺癌患者，除免疫抑制外，高凝狀態也是另一大特征，并且CD4+的變化也與凝血狀態有關[16]。本次研究結果顯示對于肺癌裸鼠模型，提高miR-15b不但會緩解高凝狀態、改善內皮功能，還可以提高CD4+和CD4+/CD8+的水平，解除免疫抑制，而抑制miR-15b具有相反的作用。此外，本次研究結果還顯示mimic組MET、PI3K、Akt水平顯著高于NC組而inhibitor組上述指標水平顯著低于NC組。MET-PI3K-Akt通路的上調，是肺癌發生和進展的重要機制，并且PI3K-Akt通路與凝血功能有關[17]。也有研究發現PI3K-Akt通路也可以誘導腫瘤細胞分泌免疫抑制抗體或調節腫瘤壞死因子等細胞因子的分泌，從而抑制免疫反應[18]。Li等[19]研究結果顯示抑制miR-15會激活PI3K/AKT通路。也有研究顯示提高miR-15b的水平可以通過激活PI3K/Akt相關通路對卵巢癌細胞起到抑制作用[20]。并且本次研究通過雙熒光素酶，報告驗證了miR-15b與MET mRNA靶向結合，提高miR-15b的水平會抑制MET的表達，這提示miR-15b對肺癌的抑制作用與MET-PI3K-Akt通路有關。

綜上所述，在肺癌裸鼠模型中，miR-15b可以誘導肺癌細胞的凋亡和抑制增殖，并促進免疫功能改善高凝狀態。但是關于miR-15b在肺癌中的作用和機制值得進一步研究。