合成微生物群落強化可控固態發酵體系的研究進展

楊 旭，宋麗麗，張志平，馬歌麗，魏 濤

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.鄭州市代謝工程和系統生物學重點實驗室，河南 鄭州 450001）

0 引言

數千年來，微生物群落一直被用于生物技術過程。如今，生物學家將微生物群落用于各種領域，如藥物、生物燃料和生物材料等的生產過程。提高對自然微生物生態系統的認識，開發新的工具來構建合成微生物群落并規劃它們的行為，將極大地擴展微生物群落的相互協作功能。

傳統固態發酵技術一般被用于生產各種代謝產物，如酶、抗生素、有機酸、生物表面活性劑和芳香化合物等。目前，將傳統固態發酵技術應用于代謝物生產、生物質開發利用和生物修復等方面，受到了廣泛關注[1]。傳統固態發酵過程通常是自然發酵產生，含有多個微生物群落[2]。由于天然微生物群落組成的波動性，發酵過程易出現代謝過程不易控制和產物不穩定等問題[3]。固態發酵過程具有原料成分多樣、參與微生物種類多、代謝反應復雜、工藝繁復以及產品組分復雜等特征，導致難以科學地闡釋其代謝機理。如何實現傳統固態發酵生態系統的微生物功能可控、生產過程可控和產品品質可控是固態發酵行業面臨的重大課題。有研究發現，微生物之間的相互作用會導致代謝產物的改善，如畢赤酵母和淀粉液化芽孢桿菌雖不是有效的風味化合物產生菌，但它們緩解了風味化合物產生菌（如釀酒酵母、東方伊薩酵母和地衣芽孢桿菌）之間的競爭，并改變了微生物的生長和風味化合物的產生[4]。微生物之間的相互作用在一些產香物質的代謝過程中起著至關重要的作用[5]。另外，微生物之間的相互作用是維持微生物群落共生的關鍵因素[6]。

目前，利用人工合成的微生物菌群將發酵過程從自然發酵轉變為人工發酵是保證可控發酵的關鍵，因為自然菌群中僅有有限的微生物才能驅動發酵過程[7]。它們不僅產生相應的代謝產物，而且保持微生物之間的相互作用，從而實現成功的發酵過程[8]。因此，揭示這些核心微生物的組成，對于構建發酵過程的合成微生物群落至關重要[9]。

人工構建的合成微生物群落并不能夠完全替代傳統發酵方面的研究，而是通過建立一個實驗條件下可控的系統來研究更深入的機制，以提高微生物群落應用于工業發酵的潛力。人工構建的微生物群落為研究傳統發酵產生的原因奠定了基礎，它可以在多個層面上進行微生物組的研究，還可以進行對某些特定微生物的基因修飾，從而研究不同組分之間的相互作用。最后，微生物群落的研究不僅可以幫助我們理解發酵過程的機理，還可以將這些知識應用到工業中，解決現在微生物組應用方面所遇到的問題，而且將合成微生物群落作為生物制劑的新策略可以構建新一代的發酵系統。合成微生物群落實現了從傳統的單一細胞行為研究擴展到多細胞微生物群落行為研究。合成微生物群落能夠通過微生物之間的相互作用，實現任務分工、功能互補，在白酒釀造、燃料生產以及污染物降解等領域有著重要的應用[10]。

1 合成微生物群落的特點

合成微生物群落是基于某個特定的目的（如模擬天然產物生產）將兩種或兩種以上的微生物在確定的環境條件下共同培養構建而成的人工群落體系[11]。合成微生物群落的構建需要考慮物種間相互作用、細胞間交流、物種代謝方式和群落空間結構等影響因素，目的是揭示發酵過程基本原理并產生可轉化為工業應用的工藝[12]。對于合成微生物群落，其主要優點是可以在受控和可重復條件下詳細地研究不同微生物的組成和功能分工，從而有助于在基因型和表型之間建立因果關系，以實現構建人工合成體系來研究微生物的功能。此外，合成微生物群落還可以在微生物和基因水平上進行添加、刪除或者替換操作，在不同層面監測改變帶來的不同結果，對于了解個體微生物在系統環境中的作用至關重要，有助于深入理解系統微生物生態的基本原理[13]。

合成微生物群落除了解析復雜發酵系統結構、功能和模型等明顯價值之外，還可以為生物技術應用開辟新的途徑[13]。目前，關于合成微生物群落的研究仍處于起步階段，這個領域將會由于大量微生物基因組的測序以及大量微生物菌株的獲得而得到快速發展。

2 構建合成微生物群落面臨的挑戰

目前，關于微生物組的研究仍停留在高通量測序以及數據關聯性分析的水平上，這就導致關于微生物群落的組裝、動態過程和抗逆性產生的原因等方面的研究還不清晰[14]。所以，要深入解決微生物組的問題，就需要嚴格設計一個在實驗室條件下可控的微生物模式群落，這須要詳細了解細胞間相互作用（包括細胞間通訊、細胞間代謝物和電子交換）和多細胞生理學的分子機制[15]。從某種意義上說，系統生物學方法能夠系統地表征微生物群落中的遺傳和代謝途徑，這為理解微生物群落相互作用的綜合分子機制提供了有用見解，可為如何構建功能性遺傳部分以及具有確定特征和多細胞行為的微生物群落提供線索[16]。因此，系統生物學不僅有助于理解合成微生物群落，而且有助于合成微生物群落的設計和優化。

3 合成微生物群落在固態發酵方面的應用

3.1 合成微生物群落在白酒釀造方面的應用

目前，提高發酵食品產品質量的主要途徑是構建合成微生物群落，合成微生物群落被廣泛應用于白酒釀造中[17]。其中，重構大曲合成微生物群落，從而管理發酵過程，是未來白酒質量控制與工業化發展的目標[18]。

根據優勢微生物的風味產生和共生功能，Wang SL[3]提供了一種系統方法來鑒定中國清香型白酒發酵過程中的核心微生物菌群（組成為Lactobacillus，Candida，Saccharomyces，Geotrichum和Pichia），見圖1。在此基礎上成功構建了一個合成核心微生物群落，以模擬體外發酵微生物群落的演替和風味化合物的產生。構建的合成核心微生物群落不僅促進了對微生物群結構和功能的理解，而且有利于建立可控固態發酵體系。

圖1 中國清香型白酒發酵過程核心微生物群落組成Fig.1 Venn diagram of the core microbiota in the fermentation process of Chinese fen-flavor liquor

Ma R F[19]將多種菌株（S.fibuligera，S.cerevisiae和P.acidilactici）以不同的方式組合，通過氣相色譜-質譜儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）和多元統計分析方法研究了所選微生物群落對白酒發酵代謝產物的影響。研究發現：在S.fibuligera和P.acidilactici的共培養物中，多數芳香族化合物的含量明顯降低，可能是由于S.fibuligera和P.acidilactici之間存在負面的相互作用；由于S.cerevisiae和乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的相互作用，在白酒釀造代謝的產物中，一些化合物（如醇和芳香族化合物）的產量明顯增高。

3.2 合成微生物群落在木質纖維原料生物轉化方面的應用

合成微生物群落的設計和構建在木質纖維原料高效轉化生物燃料方面取得了重大進展[20]。Park E Y[21]構建了一個A.cellulolyticus C-1和S.cerevisiae ATCC4126組成的合成微生物群落（圖2），顯著提高了纖維乙醇的生產效率（1 g原料可以產生0.18 g乙醇）。

圖2 利用木質纖維原料生產生物乙醇的合成微生物群落組成Fig.2 Synthetic microbial community for bioethanol production from lignocellulosic biomass

Minty JJ[22]開發了一個由真菌Trichoderma reesei RUTC30和細菌E.coli NV3 pSA55/69組成的合成微生物群落，該微生物群落能夠以木質纖維為原料合成異丁醇。Trichodermareesei RUTC30分泌纖維二糖水解酶I（CBHI），纖維二糖水解酶II（CBHII）和內切葡聚糖酶I（EGI）可以預處理玉米秸稈形成可溶性糖，并進一步水解成葡萄糖而被E.coli代謝產生異丁醇。該微生物群落可以在定量動態模型指導下進行有效調控，并能夠適應其他高價值化學品的生產。

楊旭利用復合乳酸菌群落（干酪乳桿菌、發酵乳桿菌和糞鏈球菌）對干玉米秸稈進行微貯預處理，以提高干玉米秸稈的乙醇轉化能力，實驗結果表明，在復合乳酸菌群落的厭氧發酵作用下，干玉米秸稈變得松軟，致密的纖維結構受到破壞，內部結構出現空隙和裂縫，有效提高了干玉米秸稈的生物乙醇轉化效率[23]。

3.3 合成微生物群落在生物修復方面的應用

與單一種群相比，合成微生物群落能夠執行多項任務，這對于污染物的生物降解至關重要，因為污染物的完全降解涉及到通常不存在于單一菌株中的多種酶，而且任何一個菌株均不能單獨執行污染物生物降解的總體任務[24]。目前，自然微生物群落已經被應用于環境生物修復，但是，仍然存在生物降解效率太低而不能完全滿足工業要求的問題，因為這些微生物群落的首要任務是生存，這可能會限制其生物降解污染物的能力[25]。合成微生物群落可以通過引入新的遺傳裝置和模塊來提高復雜污染物的生物降解效率[26]。

Dejonghe W[27]開發了一個包括5種菌株（Variovorax sp.WDL1，D.acidovorans WDL34，Pseudomonas sp.WDL5，H.sulfonivorans WDL6和C.testosteroni WDL7）的微生物群落（圖3），該微生物群落能夠降解除草劑利谷隆。其中，Variovorax sp.WDL1可將利谷隆降解為3，4-二氯苯胺和N，O-二甲基羥胺，D.acidovorans WDL34和C.testosteroni WDL7負責中間體3，4-二氯苯胺的降解，以保護Variovorax sp.WDL1免受中間體的毒害，H.sulfonivorans WDL6是唯一降解N，O-二甲基羥胺的菌株。

圖3 合成微生物群落在有機生物降解中的種間相互作用Fig.3 Interspecific interactions in synthetic microbial community with organic biodegradation

Chen Y[28]培養了兩種細菌Pseudomonas sp.XM-01（不能在烷烴上生長，但能夠以甘油為唯一碳源生產鼠李糖脂）和Acinetobacter sp.XM-02（一種碳氫化合物降解細菌）組成的合成微生物群落，將其用于修復石油造成的污染。其中，Acinetobacter sp.XM-02降解碳氫化合物產生中間體，中間體被Pseudomonas sp.XM-01用于生產生物表面活性劑鼠李糖脂，從而增強Acinetobacter sp.XM-02降解石油的能力。

4 結論和前景

在過去的近二十年中，學者們通過合成生物學方法構建了許多具有多種相互作用模式的微生物群落并將其應用于許多領域。這些合成微生物群落的優勢是它們具有明確的遺傳特征，并且組分之間具有易處理和可調節的相互作用，這使得學者們能夠通過許多合成生物學工具來優化它們的行為。

然而，迄今為止，學者們構建的合成微生物群落一般相對簡單，其中僅有兩種或三種工程微生物。由于天然環境（如海洋，土壤，污泥和石油）的生態結構、相互作用模式、波動環境和進化壓力的影響，使得復雜生態系統的合理設計和優化極具挑戰性。合理設計和合成能夠執行復雜生態或生物功能的種間生態系統將是一種趨勢。這樣的工程生態系統將作為新的模型系統來模擬天然存在的復雜時空行為，以利用自然界中觀察到的細胞間通信和協同合作，為時空微環境和物種間代謝相互作用對多種微生物群落穩定共存的影響提供新的見解，從而解決許多復雜的生態學問題。這些合理設計的微生物生態系統還將在化學工業、能源、環境和醫療保健領域實現新的應用。