基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討女貞子治療肝癌的機制

張 飛 劉杰民 趙 琦

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，貴州貴陽 550025；2.貴州省人民醫(yī)院消化內(nèi)鏡科室，貴州貴陽 550002；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，貴州貴陽 550003

在當(dāng)今世界范圍內(nèi)，肝癌是最為常見的致命性惡性腫瘤[1]。肝癌的主要病因包括肝炎病毒的感染、黃曲霉素、飲水污染及遺傳因素等[2]。根據(jù)肝癌的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)認為其屬于“積聚”“鼓脹”等疾病，傳統(tǒng)的中醫(yī)藥治療廣泛應(yīng)用于臨床肝癌的治療中[3-4]。

女貞子系木犀科植物女貞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果實。首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)等功效。其味苦涼，歸經(jīng)屬于肝、腎兩經(jīng)。女貞子作為補益藥，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分對肝癌的治療有顯著的效果[5]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對女貞子的抗肝癌功效做整體探討，為今后臨床上使用女貞子提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 女貞子的有效成分收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中國知網(wǎng)、萬方醫(yī)學(xué)網(wǎng)、PubMed 對女貞子的化合物成分進行檢索，其檢索時限為2011 年1 月至2020 年8 月。通過口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18或通過SwissTargetPrediction 網(wǎng)站的藥代動力學(xué)及藥物相似性對女貞子的化合物進行初步篩選。

1.2 藥物作用靶點的預(yù)測

將女貞子收集得到的有效化合物利用TCMSP 中目標(biāo)信息選項或者SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中的SwissTarget 預(yù)測選項對其有效成分進行靶點預(yù)測，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將所的到的靶點蛋白轉(zhuǎn)化為標(biāo)準的基因名稱。

1.3 構(gòu)建化合物和預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 軟件的構(gòu)圖功能，將篩選出來的化合物與預(yù)測靶點相結(jié)合，構(gòu)建女貞子的成分與靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 肝癌靶點基因的收集

利用GeneCards 和在線人類孟德爾遺傳（online Mendelian inheritance in man，OMIM）數(shù)據(jù)庫以“l(fā)iver cancer”作為關(guān)鍵詞進行檢索，然后把得到的疾病靶點進行整合，從而得出肝癌的疾病基因。

1.5 藥物和疾病的交集靶點

利用生物信息學(xué)與進化基因組學(xué)網(wǎng)站中的計算與繪制維恩圖選項，對所得到的藥物靶點基因和肝癌基因進行交集分析處理，并以維恩圖的形式體現(xiàn)出來，最終得到兩者的交集靶點基因。

1.6 構(gòu)建蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)

將得出的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析，將搜索類型限定為“智人”，根據(jù)需要設(shè)置靶點間的要求和得分得出結(jié)果，并導(dǎo)出結(jié)果。隨后，將其得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，篩選關(guān)鍵靶點。

1.7 GO 分析及KEGG 通路富集分析

Metascape 是為實驗生物學(xué)家提供全面的基因列表注釋和分析資源的數(shù)據(jù)庫[6]。使用該數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行GO 分析和KEGG 通路富集分析，設(shè)定物種限定為人并篩選出P ＜0.01的結(jié)果值。再將KEGG 分析得出的關(guān)鍵通路與靶點間的聯(lián)系利用Cytoseape 軟件進行可視化處理，繪制“靶點-關(guān)鍵通路”的網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 女貞子有效成分的篩選

通過TCMSP、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫對女貞子有效成分進行篩選，得到有效成分共有16 種，刪除無對應(yīng)靶點的6 種成分，得到最終具有良好藥效的有效成分有10 種。見表1。

表1 女貞子的有效成分

2.2 藥物靶點預(yù)測及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫對篩選出來的有效成分進行靶點的預(yù)測，選取對其評分值靠前的靶點，導(dǎo)入Uniprot 數(shù)據(jù)庫，去除重復(fù)靶點，共得出預(yù)測靶點134 個。將化合物和預(yù)測靶點通過Excel 表格的整合，導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，得出化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

圖1 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 肝癌靶點收集及維恩圖的制作

通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫得到肝癌靶點1033 個，將其與藥物預(yù)測靶點取交集，得到47 個共同靶點，即為有效靶點。見圖2、表2。

圖2 有效靶點的獲取

表2 女貞子治療肝癌的有效靶點

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將47 個有效靶點輸入String 數(shù)據(jù)庫得出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。其中網(wǎng)絡(luò)里包含47 個節(jié)點和274 個邊，平均節(jié)點度為11.7。將得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，根據(jù)節(jié)點的大小和邊的粗細提取排名靠前的11 個靶點，顏色越深、節(jié)點越大表示靶點越關(guān)鍵，其中AKT1、ESR1、EGFR 等與其他蛋白聯(lián)系較好。見圖4。

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的關(guān)鍵靶點

2.5 GO 分析

GO 分析得出與疾病最相關(guān)的20 個條目，女貞子治療肝癌的靶點主要涉及細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對氮化合物的反應(yīng)、對淀粉樣β的反應(yīng)、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽絲氨酸修飾等。見圖5。

圖5 有效靶點的GO 分析

2.6 KEGG 富集分析

KEGG 富集分析得出與疾病最相關(guān)的14 條通路，有效靶點涉及的通路主要為癌癥的途徑、前列腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的MicroRNA、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路等主要通路。見圖6。將結(jié)果利用Cytoseape 軟件進行可視化處理，得到靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。見圖7。

圖6 有效靶點的KEGG 富集分析

圖7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

肝癌在中醫(yī)學(xué)的范疇屬于“積聚”“臌脹”“黃疸”“脅痛”等疾病[7]。對于肝癌的病因病機，徐斌認為主要包括飲食不節(jié)、七情內(nèi)郁、濕毒蘊結(jié)等，從而產(chǎn)生蘊毒、氣滯、濕濁、痰凝、瘀血多種病理因素，不斷積累導(dǎo)致肝癌發(fā)生[8]。隨著中西醫(yī)的興起，中醫(yī)藥的研究也正處于新的時代。相關(guān)研究表明，女貞子的提取物對肝癌細胞具有明顯的抑制作用[9]，臨床觀察也得出具有女貞子成分的中成藥在聯(lián)合化療治療腫瘤中也具有很好的治療效果，如貞芪扶正分散片[10]。

肝癌的發(fā)生大多與體內(nèi)正邪的變化有著密切的關(guān)系，扶正祛邪在肝癌的治療中有著重大的意義。女貞子屬于補益藥中的補陰藥，有古籍記載女貞子具有主補中、安五臟、養(yǎng)精神、除百疾的功效[11]。該藥補益扶正的藥性對肝癌的治療有很大的作用。通過構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、羥基酪醇等是該網(wǎng)絡(luò)中的核心有效成分，與靶點聯(lián)系較緊密。現(xiàn)代研究表明女貞子活性成分β-谷甾醇可通過線粒體途徑將細胞周期阻滯在G2/M期，抑制肝癌HepG2 細胞生長，促進其凋亡[12]。而槲皮素在體外可抑制肝癌及其他多種腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[13]。其主要機制包括調(diào)節(jié)細胞周期、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制腫瘤組織血管內(nèi)皮生長因子表達等，與抑制AKT 信號通路讓其凋亡等有關(guān)[14]。山柰酚對肝癌Huh7 細胞生長有明顯的抑制作用[15]。羥基酪醇也可以誘導(dǎo)多種腫瘤增殖抑制及凋亡發(fā)生[16]。綜上結(jié)果所示，本研究中的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)展現(xiàn)了女貞子多成分和多靶點共同作用治療肝癌的特點。

通過搜集藥物和疾病靶點，經(jīng)過整合得出兩者的共同靶點為47 個，經(jīng)過PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析得出AKT1、ESR1、EGFR、RTGS2、SRC 等靶點在該網(wǎng)絡(luò)中處于重要地位，可以作為女貞子治療肝癌的關(guān)鍵靶點。研究表明AKT1 基因與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[17]，通過AKT1 還可明顯抑制人肝母細胞瘤細胞的增殖和侵襲，并促進其凋亡[18]。在肝臟中雌激素只有與雌激素受體，尤其是ESR1 結(jié)合后才能發(fā)揮延緩肝細胞凋亡、改善肝纖維化、抑制腫瘤生長的生物學(xué)功能[19]。可見ESR1 可以作為診斷和治療肝癌的重要靶點。研究發(fā)現(xiàn)EGFR 表達水平與肝癌細胞增殖和侵襲能力呈正相關(guān)，可作為良好的肝癌檢測指標(biāo)和治療靶點[20]。SRC 也與肝癌密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)TRIM7 通過抑制SRC-mTORC1 信號軸的活化發(fā)揮對肝癌的抑癌效應(yīng)[21]。由KEGG 通路富集分析得出這些靶點與肝癌、肝炎等通路聯(lián)系密切，與上述目前重要靶點的研究結(jié)果及女貞子活性成分和靶點作用于肝癌的治療大致相同。

通過GO 分析顯示，女貞子主要通過細胞對有機環(huán)狀化合物、氧化應(yīng)激、氮化合物、淀粉樣β的反應(yīng)等生物進程發(fā)揮其治療肝癌的作用。KEGG 通路富集分析得出，其主要富集在癌癥的途徑、前列腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的MicroRNA、TNF 信號通路、NF-κB 信號通路等。其中癌癥的途徑、前列腺癌、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的MicroRNA 均直接與癌癥包括肝癌在內(nèi)直接相關(guān)，表明女貞子有較好的抗肝癌效果。女貞子可以調(diào)控癌通路的表達，達到抑制肝癌細胞的效果。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是目前發(fā)現(xiàn)的抗癌作用較強的生物因子[22]，另外有研究證實女貞子提取物通過抑制TNF-α的表達來發(fā)揮其抗腫瘤作用[23]。這也與本研究所富集在該通路的結(jié)論可很好地吻合，提示該通路在本研究的重要性。楊金蓮[24]初步證實了酒精通過引起ROS 水平升高，進而促進NF-κB 信號通路的活化，從而介導(dǎo)肝癌生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管的生成，此外NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活對H-ras12V 轉(zhuǎn)基因雄鼠肝臟腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[25]。以上結(jié)果說明了女貞子活性成分的靶點分別作用于不同的通路，從而體現(xiàn)出其治療肝癌的作用，但是具體的通路機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究顯示女貞子治療肝癌的主要化學(xué)成分可能是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、羥基酪醇等成分，這些有效成分可以通過AKT1、ESR1、EGFR、RTGS2、SRC 等靶點及對癌癥的途徑、癌癥中的MicroRNA、TNF、NF-κB 等通路的調(diào)節(jié)，達到對肝癌有效的治療作用。本研究通過篩選女貞子治療肝癌的有效化學(xué)成分、有效靶點，以及其主要的生物進程和通路，為今后臨床上中醫(yī)中藥治療肝癌提供了新的方向和思路。