甲狀腺乳頭狀癌的FN1表達增加與BRAF突變、免疫浸潤及預后不良有關①

陳興 鄭俊杰 張愛龍 游振輝（福建醫科大學省立臨床醫學院基本外科，福州350000）

甲狀腺癌是全世界最常見的內分泌惡性腫瘤，也是最常見的頭頸部惡性腫瘤［1］。世界癌癥報告顯示，全球甲狀腺癌發病率增長迅速［2］。根據國家癌癥中心的中國癌癥統計數據顯示我國甲狀腺癌發病率近年來增幅較大，目前已位居女性惡性腫瘤發病前4位［3］。甲狀腺乳頭狀癌是最常見的甲狀腺癌，約占甲狀腺癌的85%。目前的數據顯示大多數甲狀腺乳頭狀癌患者預后良好，然而有超過25%的患者在長期隨訪中會復發疾病。因此，探索更可靠的甲狀腺乳頭狀癌進展的關鍵基因，更好地了解其潛在的機制勢在必行。

腫瘤的發生是一種以多基因表達紊亂為特征的異質性疾病，甲狀腺乳頭狀癌也是如此。目前，尚未完全了解甲狀腺乳頭狀癌進展的基本機制。基因芯片可用于快速檢測差異表達的基因，并被證實是一種可靠的技術。在過去的幾十年中，隨著基因芯片等一系列高通量技術廣泛應用，人們對癌癥的發生、發展有了進一步的認識［4-6］。基因芯片產生的基因表達譜數據可以存儲在公共數據庫中，因此可以在這些數據的基礎上探索大量有價值的線索并進行新的研究。此外，近年來已經進行了許多有關甲狀腺乳頭狀癌的生物信息學研究［1，7-10］，這證明了生物信息學方法可以有助于更好地探索其潛在機制。

本研究通過使用全面的生物信息學分析與分子生物學技術相結合來鑒定與甲狀腺乳頭狀癌相關的關鍵基因。甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織的基因表達譜用于尋找差異表達基因，用分子生物學技術進行驗證，并利用基因富集分析、蛋白-蛋白互作網絡分析提取關鍵基因。使用多個數據集進一步確定關鍵基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，同時對患者預后分析、免疫浸潤的影響進行了分析，最后通過基因共表達分析初步研判關鍵基因在甲狀腺乳頭狀癌中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病 例2018年12月 至2019年12月 在 福 建省立醫院收集了50例接受甲狀腺乳頭狀癌切除手術患者的甲狀腺癌組織和癌旁組織。甲狀腺乳頭狀癌通過組織病理學分析證實。本研究得到福建省立醫院倫理委員會的批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.2 試劑RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取將甲狀腺組織置于2 ml離心管中。加入組織裂解緩沖液800μl和20μl預冷的蛋白酶K溶液。將離心管放在搖床上，50℃溫和攪拌過夜。加入820 μl的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），輕輕混合10 min，直到溶液變成乳白色。4℃、12 000 r/min離心15 min。吸出上清液并轉移到另一個離心管中。然后將等體積的氯仿添加到上清液中，輕輕混合10 min后4℃、12 000 r/min離心15 min。將上清液轉移到另一個2 ml離心管中。加入等體積預冷的異丙醇和上清液體積10%的預冷乙酸鈉，并通過顛倒輕輕混合10次，直到觀察到絮凝沉淀為止。4℃離心5 min。棄去上清液，加入1 ml的75%乙醇后4℃下離心5 min。除去乙醇，并將沉淀物用75%乙醇洗滌1次。丟棄乙醇后4℃離心5 min。吸出剩余的乙醇，并將沉淀物風干20~30 min，直到變成半透明。接下來，添加30~50μl二次蒸餾水以溶解樣品。樣品在37℃放置30 min以更好地溶解，然后冷卻并在-20℃保存。

1.2.2BRAF-V600E突變檢測按照人類BRAF基因突變檢測試劑盒（RT-qPCR熒光探針法）的說明，采用PCR擴增，利用實時熒光Taqman探針，通過檢測熒光信號變化，明確標本的BRAF-V600E基因突變狀態。

1.2.3 熒光定量PCR使用RNA提取試劑盒提取甲狀腺乳頭狀癌組織的總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，最后用熒光定量PCR試劑擴增cDNA模板。GAPDH作為內參，表達數據采用2-ΔCt處理。所用引物序列如下：FN1（F）5'-TGAT?CACATGGACGCCTGC-3'，FN1（R）5'-GAGTCAAGCCGGACACAACG-3'；GAPDH（F）5'-ACAACTTTG?GTATCGTGGAAGG-3'，GAPDH（R）5'-GCCATCAC?GCCACAGTTTC-3'。

1.2.4 芯片數據分析3個甲狀腺乳頭狀癌基因表達譜GSE66783［11］、GSE3467［12］及GSE29265從Gene Expression Omnibus（GEO）數 據 庫 獲 得（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）。下載3個GEO數據集的原始數據文件利用R軟件進行分析。

1.2.5 差異基因篩選在本研究中，limma R包用于篩選GEO數據集甲狀腺乳頭狀癌組織和正常甲狀腺組織中的差異表達基因，從3個GEO數據集GSE3467、GSE29265及GSE66783中篩選差異表達基因，并通過韋恩圖進一步尋找3個GEO數據集中的共同基因，差異基因的篩選標準為FC>2，P<0.05。

1.2.6 樣本蛋白免疫組化檢測The Human Pro?tein Atlas（THPA）網 站（https：//www.proteinatlas.org/）提供了人類蛋白質的組織和細胞分布信息。在該數據庫中，研究人員使用高度特異性的抗體，用免疫檢測技術（免疫印跡、免疫熒光和免疫組化）詳細地檢測了每一種蛋白在64個細胞系、48種人類正常組織和20種腫瘤組織中的表達情況。THPA用于鑒定FN1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常組織中的表達情況并獲取免疫組化結果圖。

1.2.7 基因富集分析及關鍵基因鑒定使用可視化的DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）在線工具對目的基因進行基因本體論（GO，gene ontolo?gy）及信號通路（KEGG pathway）分析，富集閾值P<0.05。GO分析包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）。使用STRING數據庫（https：//string-db.org/）構建一個差異基因的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，隨后使用Cytoscape尋找關鍵基因并對其進行可視化。

1.2.8 無病生存率（disease free survival，DFS）分析FN1基因的DFS分析結果通過在線數據庫基因表達譜交互式分析（GEPIA）獲得（http：//gepia.can?cer-pku.cn/index.html）。GEPIA包含來自TCGA和GTEx項目的9 736例腫瘤和8 587例正常樣品，這些樣品包含了RNA測序結果及臨床數據。GEPIA被用于檢測基因在癌癥中的表達及包括DFS在內的生存曲線。

1.2.9 基因相關性分析在本研究中，corrgram R包用于篩選GSE3467及GSE29265數據集甲狀腺乳頭狀癌組織中與FN1表達相關的基因，并通過韋恩圖進一步尋找兩個GEO數據集中的共同基因。

1.2.10 免疫浸潤分析TISIDB（http：//cis.hku.hk/TISIDB）是一個包含了大量腫瘤免疫相關數據的網站，該網站針對30種TCGA癌癥類型，預先計算了基因與免疫功能（例如淋巴細胞、免疫調節劑和趨化因子）之間的關聯。本研究通過TISIDB網站分析了FN1與甲狀腺乳頭狀癌中激活的CD4+T細胞、激活的CD8+T細胞、激活的B細胞、激活的樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、調節性T細胞及自然殺傷 性T細胞的 相關性。TIMER（https：//cis?trome.shinyapps.io/timer/）主要用于計算基因表達與6種腫瘤浸潤免疫細胞（B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）之間的關聯，本研究通過TIMER網站分析了FN1與甲狀腺乳頭狀癌中B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞的相關性。

1.3 統計學分析使用Prism 5.0軟件進行統計分析，基因表達數值以±s表示。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌中差異表達基因的鑒定及功能預測為了在甲狀腺乳頭狀癌和臨近的正常組織中發現差異表達的基因，選擇甲狀腺乳頭狀癌組織與癌旁組織配對的3個GEO數據集（GSE3467、GSE29265及GSE66783）進行分析。在GSE3467數據集中的6對甲狀腺乳頭狀癌及癌旁中有608個差異基因，其中甲狀腺乳頭狀癌組織中上調表達的基因有253個，下調表達的基因有355個（圖1A、B）。在GSE29265數據集中的10對甲狀腺乳頭狀癌及癌旁中有306個差異基因，其中甲狀腺乳頭狀癌組織中上調表達的基因有162個，下調表達的基因有144個（圖1C、D）。在GSE66783數據集中的5對甲狀腺乳頭狀癌及癌旁中有2 887個差異基因，其中甲狀腺乳頭狀癌組織中上調表達的基因有1 275個，下調表達的基因有1 612個（圖1E、F）。

圖1 在mRNA表 達 譜 數 據 集GSE3467、GSE29265及GSE66783中鑒定差異表達基因Fig.1 Differential expression genes in mRNA expression profile data sets of GSE3467，GSE29265 and GSE66783

進一步分析發現3個GEO數據集中有142個基因表現出相同的表達趨勢（圖2A）。對這些差異基因進行功能富集分析（圖2B~D），結果表明這些差異的基因主要富集于BMP信號通路、Wnt信號通路、Rac蛋白信號轉導等通路。信號通路富集分析結果表明這些差異基因富集與甲狀腺癌、p53信號通路、癌癥信號通路、ECM受體相互作用、酪氨酸代謝等信號通路有關（圖2E）。以上分析結果表明從甲狀腺乳頭狀癌組織中篩選到的差異基因與甲狀腺癌、p53及其他信號通路相關，這在一定程度上佐證了分析數據的有效性及可靠性。同時，本研究使用STRING在線數據對這142個差異基因進行蛋白網絡互作分析，并使用Cytoscape軟件進行可視化分析（圖2F），結果顯示FN1基因在這些差異基因中起著重要作用。

圖2 差異基因的功能預測及關鍵基因的鑒定Fig.2 Functional prediction of differentially expressed genes and identification of key genes

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達的FN1與不良預后及BRAF突變有關為了進一步明確FN1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，在50例甲狀腺乳頭狀癌患者中檢測了FN1的表達。結果顯示，與癌旁組織相比，FN1的mRNA在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達顯著上升（圖3A）。通過The Human Protein atlas網站分析FN1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，結果顯示FN1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中處于高表達狀態（圖3B），在甲狀腺正常組織中的表達處于低表達水平（圖3C）。進一步的無病生存率分析結果顯示FN1表達低的甲狀腺乳頭狀癌患者無病生存率顯著優于FN1表達高的甲狀腺乳頭狀癌患者（圖3D）。BRAF（B-Raf proto-oncogene，serine/threonine kinase）基因是一種原癌基因，V600E代表的是BRAF基因最容易癌變的一個位點。經過大量研究證實，BRAF-V600E基因突變與甲狀腺乳頭狀癌的診斷、治療和判斷預后都有重要聯系。BRAF-V600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌患者復發轉移的概率高于未發生BRAF-V600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌患者。因此，在50例甲狀腺乳頭狀癌組織中檢測了FN1表達與BRAF-V600E基因突變的關系。在50例病例中，有29例檢測到了BRAF-V600E突變；21例甲狀腺乳頭狀癌組織及50例癌旁組織未檢測到BRAF-V600E突變。在BRAFV600E突變組織中，FN1表達顯著高于BRAF未突變組織，這表明了FN1是甲狀腺乳頭狀癌預后相關的一個重要基因。

2.3FN1表達與甲狀腺乳頭狀癌的免疫浸潤水平相關腫瘤浸潤性淋巴細胞是一類腫瘤浸潤性且具有抗原效應的細胞群，在腫瘤的發生、發展中起重要作用。因此，通過TISIDB網站檢測了FN1表達是否與甲狀腺乳頭狀癌的免疫浸潤水平有關。結果顯示FN1表達水平與較高的免疫浸潤有關，FN1表達水平與激活的CD8+T細胞（r=0.263，P=2.04e-09，圖4A）、激活的CD4+T細胞（r=0.575，P<2.2e-16，圖4B）、激活的B細胞（r=0.202，P=4.75e-06，圖4C）、激活的樹突狀細胞（r=0.441，P<2.2e-16，圖4D）、中性粒細胞（r=0.551，P<2.2e-16；圖4E）、巨噬細胞（r=0.485，P<2.2e-16，圖4F）、調節性T細胞（r=0.627，P<2.2e-16，圖4G）、自然殺傷性T細胞（r=0.491，P<2.2e-16，圖4H）有相關性。同時，也利用了TIMER網站進一步驗證了FN1表達與甲狀腺乳頭狀癌的免疫浸潤呈正相關（圖4I），結果顯示FN1表達水平與甲狀腺乳頭狀癌的B細胞（r=0.427，P=8.19e-23）、CD8+T細胞（r=0.062，P=1.75e-01）、CD4+T細胞（r=0.435，P=6.40e-24）、巨噬細胞（r=0.381，P=2.46e-18）、中性粒細胞（r=0.601，P=2.83e-49）和樹突狀細胞（r=0.59，P=9.67e-47）有相關性。這些結果表明，FN1在甲狀腺乳頭狀癌的免疫浸潤中起重要作用。

圖4 FN1的表達與甲狀腺乳頭狀癌的免疫浸潤水平有關Fig.4 Correlation between FN1 expression and immune infiltration of papillary thyroid carcinoma

2.4 甲狀腺乳頭狀癌組織中FN1共表達基因富集于p53信號通路為更好地了解FN1在甲狀腺乳頭狀癌中的作用機制，本研究分析了GSE3467及GSE29265癌組織中與FN1表達相關的基因（r>0.5）。結果顯示在GSE3467中與FN1表達正相關的基因有4 760個，在GSE2965中與FN1表達正相關的基因有2 721個，其中共有基因957個（圖5A）。對這些差異基因進行功能富集分析（圖5B~D），結果表明這些差異基因主要富集于細胞間黏附、蛋白質泛素化、蛋白質轉運等通路。信號通路富集分析結果表明這些差異基因富集與p53信號通路、癌癥中的碳代謝、細菌侵襲上皮細胞等通路相關（圖5E），其中，引起我們興趣的是p53信號通路，因為在圖2E中發現甲狀腺乳頭狀癌組織中差異表達的基因富集在p53信號通路。在p53信號通路中共有16個基因的表達與FN1的表達正相關（圖5F），這16個基因分別是BID（BH3 interacting domain death agonist）、CDK1（cyclin-dependent kinase 1）、ZMAT3（zinc finger，matrin-type 3）、SFN（stratifin）、PMAIP1（phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1）、CCNG1（cyclin G1）、DDB2（damage-specific DNA binding protein 2）、MDM2（MDM2 proto-oncogene）、APAF1（apoptotic peptidase activating factor 1）、FAS（fas cell surface death receptor）、PERP（PERP，TP53 apoptosis effector）、CCNG2（cyclin G2），PTEN（phos?phatase and tensin homolog）、CDKN1A（cyclin-depen?dent kinase inhibitor 1A）、RRM2（ribonucleotide re?ductase M2）、GADD45A（growth arrest and DNA-dam?age-inducible，alpha）。GSE3467數據集及GSE29265數據集中這16個基因與FN1表達的相關性如圖5G、H所示。同時，使用STRING在線數據對這16個基因及FN1基因進行蛋白網絡互作分析，并使用Cytoscape軟件進行可視化分析，結果顯示FN1基因與這16個基因存在互作網絡關系（圖5I）。

圖5 甲狀腺乳頭狀癌組織中FN1表達正相關基因分析Fig.5 Genes positively correlated with FN1 expression in papillary thyroid carcinoma tissue

為了進一步明確與FN1共表達的16個p53信號通路的基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達，本研究在GSE29265的10例甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中檢測這16個基因的表達。結果顯示16個基因中有15個基因在甲狀腺乳頭狀癌中上調表達，分別是BID（P<0.01；圖6A）、CDK1（P<0.05；圖6B）、ZMAT3（P<0.01；圖6C）、SFN（P<0.01；圖6D）、PMAIP1（P<0.05；圖6E）、CCNG1（P<0.05；圖6F）、DDB2（P<0.01；圖6G）、MDM2（P<0.01；圖6H）、APAF1（P<0.01；圖6I）、FAS（P<0.05；圖6J）、PERP（P<0.05；圖6K）、CCNG2（P>0.05；圖6L）、PTEN（P>0.05；圖6M）、CDKN1A（P>0.05；圖6N）、RRM2（P>0.05；圖6O），有1個基因在甲狀腺乳頭狀癌中下調表達，這個基因是GADD45A（P>0.05；圖6P）。這些結果表明甲狀腺乳頭狀癌中FN1的表達與p53信號通路的表達有一定相關性。

圖6 p53信號通路相關基因在甲狀腺乳頭狀癌中的表達Fig.6 Expression levels of genes correlated with p53 sig?nal pathway in papillary thyroid carcinoma tissue

3 討論

本研究從3個甲狀腺乳頭狀癌GEO數據集中鑒定出142個差異表達的基因，富集分析表明，大多數差異表達的基因可能與甲狀腺癌發生、p53信號通路相關。蛋白-蛋白相互作用分析結果顯示FN1是樞紐基因。

FN1是糖蛋白家族的成員，在多種細胞類型中均檢測到表達。FN1在細胞黏附、生長、遷移和分化中起主要作用，對傷口愈合和胚胎發育等過程非常重要。FN1表達失調與癌癥進展有關，如前列腺癌、腸癌、胃癌及腎癌等［13-17］。最近的研究表明，FN1在腫瘤細胞中的表達增加與患者的預后負相關。

通過檢測50例甲狀腺乳頭狀癌組織中FN1的表達，結果發現FN1在甲狀腺乳頭狀癌中表達顯著上調，且BRAF-V600E基因突變的甲狀腺乳頭狀癌組織中FN1表達水平提高。

通過無病生存率曲線分析發現FN1高表達的患者預后更差，這些結果表明FN1可能是甲狀腺乳頭狀癌中新的有重要價值的預后標志物。同時，通過TISIDB和TIMER網站分析發現FN1表達水平與甲狀腺乳頭狀癌免疫浸潤水平相關，結果表明FN1表達水平與CD4+T細胞、激活的CD4+T細胞、樹突狀細胞、激活的樹突狀細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、調節性T細胞及自然殺傷性T細胞顯示出中等或強的相關性，與激活的CD8+T細胞及激活的B細胞有著弱相關性。TISIDB和TIMER網站是用于分析基因表達與癌癥組織免疫浸潤相關的兩個網站，其分析結果的可信度已經在眾多研究中得到驗證［18-20］。根據兩個網站的分析結果，表明了FN1的表達在甲狀腺乳頭狀癌中的免疫細胞浸潤中起重要作用，因此值得后續利用免疫組化等技術分析FN1與甲狀腺乳頭狀癌組織中腫瘤浸潤免疫細胞的關系。

目前關于FN1在腫瘤中的作用機制研究較少。本研究通過基因共表達分析，從兩個GEO數據集在甲狀腺乳頭狀癌中鑒定出957個與FN1強共表達的基因。信號通路富集分析發現這些基因富集在多條信號通路中，其中最為顯著的是p53信號通路，包含16個基因。蛋白-蛋白互作分析發現FN1與p53信號通路中的16個基因具有相互作用關系，進一步分析發現這16個基因大多在甲狀腺乳頭狀癌中高表達。因此FN1的表達與甲狀腺乳頭狀癌p53信號通路有一定的相關性。

綜上所述，FN1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達增加，其高表達與BRAF突變及預后顯著相關，此外FN1的表達與甲狀腺乳頭狀癌的免疫浸潤及p53信號通路相關。雖然需進一步研究以明確FN1與甲狀腺乳頭狀癌免疫浸潤及p53信號通路的相關性，但本研究成果為以后開展FN1的機制研究提供了一個新的方向，同時也證實了FN1的表達可作為甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷及預后標志物。