Ⅲ型纖連蛋白樣包含結構域1 蛋白在食管癌組織中的表達及臨床意義

袁慶鋒 張 琪 楊云杰

四川省巴中市中心醫院胸心外科，四川巴中 636000

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤。我國是食管癌高發的國家之一，每年新發病例達24.6 萬例，發病率為17.9/10 萬，死亡率為13.7/10 萬[1]。目前食管癌的治療包括手術、放化療等，但部分患者即使經積極治療后，仍易出現腫瘤復發、轉移等惡性進展[2]。Ⅲ型纖連蛋白樣包含結構域1（Ⅲtype fibronectin like inclusion domain 1，FNDC1）基因位于6q25.3，屬于纖連蛋白家族成員，在表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子信號傳導中發揮重要的作用[3]。研究表明，FNDC1 在高血壓[4]、心肌梗死[5]及腫瘤[6]等疾病中發揮重要的生物學調控作用，其可以通過促進下游基因的高甲基化促進細胞遷移和增殖等生物學行為，影響疾病的發生發展。最近的一項研究[7]發現FNDC1 在食管癌細胞系中表達較高，過表達FNDC1 后能夠促進腫瘤細胞的增殖及遷移。本研究通過分析食管癌中FNDC1的表達及臨床意義，為發現潛在的食管癌腫瘤標志物提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年4 月至2015 年4 月四川省巴中市中心醫院（以下簡稱“我院”）診治的食管癌患者93例。納入標準：①均為初次診治；②根據病理學檢查明確診斷，由2 位病理醫師共同閱片。排除標準：①合并食管狹窄、反流性食管炎及食管結核等食管良性疾病；②合并嚴重心肺肝腎等臟器功能障礙；③合并類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等自身免疫系統疾病；④既往有惡性腫瘤病史及治療史。本研究均經患者知情同意并簽署知情同意書，本研究已經我院醫學倫理委員會審核批準通過。所有食管癌患者自確診之日起開始隨訪，以電話方式，每3 個月隨訪1 次，隨訪5 年，隨訪內容為患者生存情況。隨訪截止至2020 年5 月，隨訪終點為患者復發或隨訪結束。

1.2 熒光定量PCR 檢測組織中FNDC1的表達

應用Trizol 法提取組織中總RNA，Narodrop 檢測RNA的濃度和純度。將總RNA 反轉錄合成cDNA，-20℃保存。反轉錄試劑盒購自北京天根公司，貨號：KR123。反應體系：SYBR Green premix 10 μl，正向及反向引物各1 μl，cDNA 模板1 μl和ddH2O 7 μl。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，70℃延伸30 s，共40 個循環。FNDC1的正向引物序列：5’-GCCAAGGCATGTGAAACTG-3’，反向引物序列：5’-CTGGTAGCATCTTTGGGTGGG-3’，以GAPDH 為內參，GAPDH正向引物序列5’-ACCCAAAGAT-GCTACCAGTAGA-3’，反向引物序列：5’-AGCAGCA-CAAAGTACACTACC-3’。采用2-△Ct法表示組織中FNDC1的相對表達量。

1.3 免疫組化檢測組織中FNDC1 蛋白表達

將組織用10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，厚度4 μm，二甲苯脫蠟；梯度水化；高壓鍋檸檬酸緩沖液抗原熱修復；3%雙氧水去除內源性過氧化物酶；5%羊血清，室溫封閉30 min；一抗4℃孵育過夜（FNDC1 稀釋比1∶200，購自abcam 公司，貨號：174833）；二抗，室溫2 h；DAB 顯色3 min；蘇木精染核30 s（小鼠/兔超敏聚合物法檢測二步法通用試劑盒購自北京中衫金橋公司，貨號：PV-8000）；梯度脫水后封片鏡檢。染色結果結合高倍鏡視野（200×）下染色強度評估，不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色顆粒為2 分，棕黃色為3 分。每個標本取5 個視野，結果取平均值。0～1 分判定為染色陰性，2～3 分為染色陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料采用例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用R×C 列表χ2檢驗。Kaplan-Meier 生存分析（Log-rank 檢驗）食管癌組織中不同FNDC1表達的預后生存差異。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌及癌旁組織中FNDC1 mRNA表達比較

食管癌組織中FNDC1 mRNA的相對表達量為（2.12±0.35），癌旁組織中的相對表達量為（1.04±0.20）。癌組織中FNDC1 mRNA的相對表達量明顯高于癌旁組織（t=25.837，P=0.000）。

2.2 食管癌及癌旁組織中FNDC1 蛋白表達比較

FNDC1 陽性棕褐色染色主要位于癌組織中腫瘤細胞的細胞漿。腫瘤組織中FNDC1 蛋白的陽性表達率為66.7%（62/93），癌旁組織中為10.8%（10/93）。癌組織中FNDC1 蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織（χ2=61.275，P=0.000）。見圖1（封四）。

圖1 免疫組化檢測食管癌及癌旁組織中FNDC1蛋白表達(200x)

2.3 癌組織中FNDC1的表達與臨床病理特點的關系

癌組織中FNDC1的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移有關聯（均P ＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置及病理分級無關聯（均P ＞0.05）。見表2。

表2 癌組織中FNDC1表達與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.4 癌組織中FNDC1的表達與臨床預后的關系

本研究中，93 食管癌患者隨訪3～60 個月，平均隨訪時間（26.1±11.2）個月，隨訪期間死亡74例，存活19例，期間無失訪病例。5 年總體生存率（OS）為20.4%（19/93）。FNDC1 陽性和陰性患者的5 年OS 分別為6.5%（4/62）、48.4%（15/31）。Kaplan-Meier 生存分析（Log-rank 檢驗）結果FNDC1 陽性患者5 年OS顯著低于陰性患者（χ2=4.557，P=0.032），FNDC1 陽性平均生存時間為（18.4±5.7）個月，而FNDC1 陰性患者平均生存時間為（29.6±6.2）個月，FNDC1 陽性患者的平均生存時間顯著短于FNDC1 陰性患者（t=8.675，P <0.001）。見圖2。

圖2 癌組織中FNDC1的表達與臨床預后的關系

3 討論

食管癌是癌癥相關死亡的第六大原因，世界范圍內每年新確診患者例數達45 萬，其發病率呈不斷增加的趨勢，嚴重威脅人類健康[8-11]。部分患者發現時已處于晚期，喪失手術最佳治療時機，預后不佳[12-15]。因此有必要深入研究食管癌疾病發生發展的分子機制。食管癌發生的危險因素包括種族、飲食、飲酒、遺傳易感性等，特別是環境因素導致的遺傳學改變、表觀遺傳學改變是食管癌發生發展過程中重要的機制。

FNDC1 屬于FNDC 家族成員，研究發現，FNDC1參與組織發育、細胞黏附、遷移和增殖等生物學過程[16-17]。有學者報道，在肺動脈高壓、惡性腫瘤等多種疾病中，FNDC1 能夠激活細胞表面受體G 蛋白信號傳導8（AGS8），促進細胞的增殖、抑制凋亡，進而導致疾病的發生發展[18-19]。本研究中，食管癌癌組織中FNDC1 mRNA的相對表達量及FNDC1 蛋白表達陽性率均顯著高于癌旁組織。目前食管癌中FNDC1表達上調的機制尚不清楚。分析其可能機制，一方面與FNDC1 受微小RNA（miRNA）的轉錄后調控有關[20-21]。有研究報道，miR-1207-3p 能夠結合FNDC1 mRNA的3’端非編碼區，降低FNDC1 mRNA的穩定性，抑制FNDC1的表達，而腫瘤中miR-1207-3p表達下調，導致FNDC1的表達水平升高。另一方面，腫瘤微環境中轉化生長因子β表達水平升高能夠激活皮質類固醇受體，進而促進腫瘤細胞FNDC1的表達[22]。本研究中，癌組織中FNDC1的表達與腫瘤分期及淋巴結轉移有關，提示FNDC1的表達促進食管癌的發生發展。其機制與FNDC1 參與表皮生長因子（vascular epidermal growth factor，VEGF）介導的血管及淋巴管生成中的重要作用有關。有研究報道，FNDC1 能夠激活細胞表面受體AGS8，調節血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）的亞細胞分布，促進VEGF-A 誘導的血管內皮細胞信號傳導與血管內皮細胞的生長，促進腫瘤血管生成，導致腫瘤分期升高[18]。此外，FNDC1 激活AGS8 后，參與腫瘤細胞中VEGF-C的表達，VEGF-C 通過促進淋巴管內皮細胞中蛋白激酶B的磷酸化，刺激淋巴管內皮細胞的增殖和淋巴管形成，進而促進腫瘤的淋巴管轉移[23]。以往研究發現，腫瘤組織中FNDC1的表達與腫瘤患者的生存預后關系密切，其表達水平有助于預測患者的生存預后情況[24]。因此，為進一步分析食管癌中FNDC1表達的預后價值，結果發現FNDC1陽性表達的食管癌患者5 年OS 及平均生存時間均較陰性表達患者明顯縮短，提示食管癌組織中FNDC1的表達有助于預測食管癌患者的生存預后，有可能成為判斷食管癌患者預后的腫瘤標志物。以往有學者在胃癌中亦發現，高表達FNDC1的患者生存預后較差，其原因是FNDC1表達水平的升高會促進腫瘤細胞的增殖及遷移等惡性生物學行為，促進腫瘤的惡性進展低[25]，患者對治療的反應差，導致預后不佳[26-27]。

綜上所述，食管癌組織中FNDC1表達上調，食管癌中FNDC1的表達與腫瘤分期、淋巴結轉移有關，并且FNDC1的表達與患者的不良生存預后有關，有望成為新的判斷食管癌預后的腫瘤標志物及潛在治療靶標。