樺褐孔菌醇提物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

付雯雯，劉學瑩，崔賀銘，張玉瑩，于 萍，李沅耕，鄔 丹，高 洋，武 毅*

（1.吉林大學藥學院，長春 130021；2.日本國神奈川縣川崎市納米醫療創新中心，川崎 210-0821）

心肌缺血是一種具有高發病率和高病死率的心血管疾病，重建血液供應是治療心肌缺血的主要手段，但血流恢復過程中產生的嚴重刺激進一步加重了心肌損傷[1]，可能導致患者產生心肌頓挫和心律失常等，發生心肌缺血再灌注（MI/R）損傷的病理現象[2]。研究[3-4]表明，心肌缺血再灌注損傷的發生可能與MI/R過程中產生大量活性氧及其引起的氧化應激、鈣超載和心肌細胞凋亡和炎癥等有關。因此，有效緩解心肌缺血再灌注損傷具有重要意義。樺褐孔菌（inonotus obliquus）是一種生長在白樺樹上的可食用真菌，其主要生物活性成分為多糖、多酚、黑色素和三萜等[5]。研究[6-7]顯示樺褐孔菌具有抗腫瘤、降血脂、調節代謝紊亂和抗氧化等作用，但樺褐孔菌在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究較少。本實驗旨在探究樺褐孔菌醇提物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，并初步探討其潛在的保護作用機制。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

樺褐孔菌（inonotus obliquus）采集自吉林省；AST試劑盒、LDH試劑盒、CK-MB試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-px試劑盒和CAT試劑盒購自南京建成生物工程研究所。彩色多普勒超聲便攜機GE Vivid I（GE Healthcare），電熱鼓風干燥箱101A-3E（上海實驗儀器廠有限公司），電子天平ALC-10.4（上海精密科學儀器公司），離心機TDL-40B（上海安亭科學儀器廠），高速低溫離心機D37520（Heraeus）；制冰機SIM-F140（SANYO），低溫冰柜U570（NBS），酶標儀PC384（Molecular Devices），電動玻璃勻漿機DY89-I（寧波新芝科器研究所）。

1.2 實驗動物

雌性健康Wistar大鼠125只，體質量230～250 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，合格證號：SCXK（遼）-2015-0001。

1.3 樺褐孔菌醇提物制備

精密稱重樺褐孔菌2 500 g，在室溫下浸入12.5 L蒸餾水中過夜，在80 ℃下提取2.5 h，再通過3層紗布過濾后收集上清液，重復2次。旋轉蒸發濃縮濾液，然后在60 ℃下干燥，壓碎過80目篩子以獲得初提物。將初提物加入12.5 L 95%乙醇，在75 ℃下提取2.5 h。通過3層紗布過濾收集上清液，重復萃取2次。收集濾液并旋轉蒸發濃縮，然后在60 ℃下干燥，壓碎并過80目篩子以獲得樺褐孔菌醇提物備用。

1.4 實驗分組

將Wistar大鼠隨機分為5組：假手術組，模型組，樺褐孔菌醇提物150、300、600 mg·kg-1劑量組，每組25只大鼠。假手術組和模型組大鼠每天灌胃給予0.5% CMC-Na，樺褐孔菌醇提物組大鼠每天灌胃給予相應劑量的樺褐孔菌醇提物，每天1次，連續給藥7 d。

1.5 模型建立方法

各組大鼠末次給予樺褐孔菌乙醇提取物1 h后，進行手術操作：將大鼠麻醉后，固定在手術臺上進行開胸，使大鼠心臟暴露，于其下2 mm處，用0號手術線對各組大鼠冠狀動脈左前降支進行結扎，結扎2 h后，拉松結扎線，進行再灌注2 h，建立MI/R模型，對于假手術組大鼠，只進行手術操作，不進行結扎。MI/R模型建立成功后，檢測大鼠心臟功能、心肌梗死面積、血液生化學等相關指標。

1.6 觀察指標

1.6.1 心臟功能檢測 再灌注2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。應用彩色多普勒超聲便攜機檢測大鼠心臟功能相應指標。各指標參數以雙盲方式進行測量，測量結果為連續3個心動周期的平均值。

1.6.2 心肌梗死面積檢測 再灌注2 h后，處死大鼠剖取心臟，測定心肌梗死面積。用生理鹽水對大鼠心腔進行清洗，切除心房，對左心室濕重進行稱量，再將左心室進行切片，將切片樣本放置于0.5%NBT磷酸緩沖液中浸沒，在37 ℃水浴條件下孵育20 min。染色結束后取出切片標本進行觀察。心肌梗死的面積百分比計算=缺血心肌組織重/左心室濕重×100%。

1.6.3 心肌三酶的測定 再灌注2 h后，采集大鼠腹主動脈血1 mL，將血液樣本靜置2 h后，用離心機以2 000 r·min-1進行離心，10 min后分離出血清。按照試劑盒說明書的方法檢測大鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）活性。

1.6.4 心肌組織中氧化應激指標測定 再灌注2 h，采血結束后，取出大鼠心臟用于進行大鼠心肌組織勻漿的制備。用預冷生理鹽水反復清洗大鼠的心肌組織，將殘留的血液去除后，將心肌組織用濾紙拭干，進行稱質量。在樣本中加入生理鹽水，在低溫條件下用玻璃勻漿機獲取勻漿樣本。用離心機進行離心，轉速為3 500 r·min-1，時間為15 min，移取上清液分裝至潔凈的EP管中，在-80 ℃的環境下保存。樣本制備完成后，按照試劑盒說明書的方法檢測心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用Student’st-test，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心臟功能比較

見表1。

表1 各組大鼠心臟功能比較（±s，n= 8）

表1 各組大鼠心臟功能比較（±s，n= 8）

注：與假手術組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（mg·kg-1） LVIDd/mm LVIDs/mm LVEF/% LVFS/%假手術組 — 4.00±0.54 2.50±0.54 85.63±3.66 48.88±5.89模型組 — 6.25±1.16## 4.38±0.52## 51.75±6.39## 24.13±5.00##樺褐孔菌醇提物組150 5.25±0.46△ 3.63±0.52△ 63.25±4.83△△ 31.50±4.34△△300 5.13±0.83△ 3.50±0.53△△ 70.13±4.76△△ 37.25±5.06△△600 5.00±0.76△ 3.38±0.52△△ 72.38±4.27△△ 39.13±5.19△△

2.2 各組大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比較

見表2。

表2 各組大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比較（±s，n= 10）

表2 各組大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比較（±s，n= 10）

注：與假手術組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別劑量/（mg·kg-1）CK-MB/（ng·mL-1）AST/（U·L-1）LDH/（U·L-1）假手術組 — 74.40±9.51 27.66±3.13 11 472.22±881.40模型組 — 130.98±13.97## 67.04±5.39## 15 144.22±509.96##樺褐孔菌醇提物組150 92.62±12.81△△ 52.39±7.34△△ 13 581.09±672.32△△300 80.78±12.36△△ 48.19±8.05△△ 13 329.67±835.27△△600 77.15±12.45△△ 41.79±7.12△△ 13 071.21±663.15△△

2.3 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比較

見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比較（±s，n= 10）

表3 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比較（±s，n= 10）

注：與假手術組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量 /（ mg·kg-1） MDA/（nmol·mgprot-1） SOD/（U·mgprot-1） CAT/（U·mgprot-1） GSH-px/（U·mgprot-1）假手術組 — 1.40±0.24 321.97±55.66 3.82±0.56 7.99±0.95模型組 — 2.60±0.29## 237.05±30.75## 2.66±0.24## 4.35±0.64##樺褐孔菌醇提物組150 2.06±0.19△△ 279.94±50.61△ 3.21±0.48△△ 6.69±0.94△△300 1.74±0.37△△ 289.28±26.50△△ 3.61±0.53△△ 6.79±1.59△△600 1.70±0.38△△ 295.10±38.85△△ 3.68±0.46△△ 7.03±0.86△△

2.4 各組大鼠心肌梗死面積比較

見表4。

表4 各組大鼠心肌梗死面積比較（±s，n= 10）

表4 各組大鼠心肌梗死面積比較（±s，n= 10）

注：與假手術組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量 /（mg·kg-1） 梗死面積/%假手術組 — 0.00±0.00模型組 — 38.13±4.72##樺褐孔菌醇提物組150 25.42±5.69△△300 22.56±4.20△△600 21.07±5.26△△

3 討論

再灌注是臨床上治療心肌缺血的有效手段，然而在心肌缺血再灌注過程中，心肌細胞經歷了缺氧/復氧及PH突然變化，血管阻塞，導致氧化應激等現象發生，從而誘導心肌細胞發生凋亡，對心臟結構造成破壞[8]。因此，開發新的治療藥物以減少再灌注過程對心肌組織產生的進一步損傷具有重要的理論和現實意義。近年來，從傳統醫藥中發現新型治療藥物成為研究熱點，研究[9-10]表明傳統醫藥在對抗心肌缺血再灌注損傷中發揮重要作用。樺褐孔菌是生長在西伯利亞的可食用真菌，早在16世紀就開始被用來防治多種疾病。研究[11-12]發現，其有良好的抗氧化、抗炎等藥理作用。研究[13]表明，樺褐孔菌能有效抑制心肌細胞的凋亡，提高心肌細胞活力。研究結果顯示，與模型組比較，樺褐孔菌醇提物各劑量組能明顯改善大鼠心臟功能，減小心肌梗死面積，表明樺褐孔菌醇提物在缺血再灌注過程中對心肌組織具有保護作用。

在心肌缺血再灌注過程中，產生大量的活性氧，導致機體氧自由基的產生和清除的平衡被打破，使得機體進入氧化應激狀態，對心肌造成損傷[14-15]。氧化應激狀態下，大量的氧自由基會導致脂質過氧化對膜磷脂造成損壞，對心肌細胞膜完整性造成破壞，使心肌酶從胞內漏出。因此血清中的心肌酶的活性水平可以反映心肌細胞受損的程度[16-17]。在氧化應激條件下，發生脂質過氧化反應，并最終產生MDA[18]。MDA是脂質過氧化的標志物，它可以進一步引起蛋白質，核酸和其他生物大分子的交聯聚合，從而進一步損害細胞，同時它的含量也用作反應氧化應激程度的指標[19]。SOD、CAT、GSH-px是機體的抗氧化酶，可以清除體內的氧自由基，其活性水平代表了機體清除氧自由基及對抗氧化應激的能力[20]。本研究結果顯示，與模型組比較，樺褐孔菌醇提物各劑量組能顯著降低血清中CK-MB、AST和LDH活性，同時降低SOD、CAT、GSH-px活性，增強MDA含量，表明樺褐孔菌醇提物可以抑制氧化應激產生的脂質過氧化，并增強機體氧自由基的清除能力。

綜上所述，樺褐孔菌醇提物可以對抗心肌缺血再灌注損傷過程中產生的氧化應激反應，增強心肌細胞對氧自由基的清除能力，對心肌細胞起保護作用。