基于UPLC-LTQ-Qrbitrap代謝組學技術的不同產地黃芩組分比較研究

吳樣明，邵 堅，孫函靜，甘 俠，余明鏡，季巧遇，2*

(1.江中藥業股份有限公司，江西 南昌 330004；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330004)

黃芩為唇形科植物ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，臨床中常用于治療濕溫、暑濕、胸悶嘔惡、濕熱痞滿等病癥[1]。黃芩主要產于我國黑龍江、遼寧、內蒙古等地；其中熱河黃芩以藥效好、品質佳而被市場認可，是屬于河北承德產的道地藥材[2]。不同產地黃芩資源物質基礎存在一定的差異，僅通過單個指標黃芩苷進行質量評價有一定局限性，不利于黃芩的臨床應用和研究。不同產地的黃芩與傳統道地產區熱河黃芩內在的物質基礎是否一致仍然不確定，故對道地黃芩與其他產區黃芩的物質內涵進行一致性評價非常重要。本研究基于LTQ-Orbitrap技術對道地藥材熱河黃芩與山西聞喜、陜西澄城黃芩進行代謝組學分析，旨在揭示不同產地黃芩與道地產區黃芩中化學組分的一致性和差異性，為黃芩道地藥材化學表征及優勢資源篩選提供一定的科學依據。

1 儀器與材料

1.1 材料

黃芩藥材來自河北承德縣、山西聞喜縣、陜西澄城縣，每個產地4個采集點，且每個采集點2批次，共24批次黃芩藥材，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器

DionexUitiMate 3000(Thermo Fisher 科技有限公司)，ORBITRAP ELITE 質譜儀(Thermo 公司)，MSA224S電子天平(德國Sartorius)，數控超聲波清洗器(KQ1000KDE型，40 kHz，昆山市儀器超聲有限公司)，碎機(A11BS025，IKA)。

1.3 試劑

甲醇、乙腈為色譜純級(Merck KGaA公司)，甲酸為質譜級(Thermo Fisher 科技有限公司)，超純水(Millipore 公司，美國)。

2 方法

2.1 樣品制備

取本品中粉約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，稱重，用甲醇補足，搖勻，用0.22 μm微孔膜濾過，取續濾液備用。質控樣本(QC樣)為各待測樣品等量混合而成。QC樣本每5針進樣結束后進一次樣，用于評估儀器的穩定性。

2.2 色譜條件與質譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜條件：Waters XSelect HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流動相為0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～18 min，8%B→35%B；18～21 min，35%B→60% B；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃，進樣量2 μL。

2.2.2 質譜條件 質譜條件：FT Orbitrap 質量檢測器，電噴霧(ESI) 離子源，噴霧電壓4.0 kV，管狀透鏡電壓110 V，掃描范圍m/z100～800；毛細管溫度350 ℃；鞘氣流量為30 Psi；輔助氣流量為10 Psi；樣品進行全掃描，分辨率R設為30 000；二級質譜采用數據依賴性掃描，從上一級峰度最高的3個峰選取進行CID 碎片掃描。

2.3 數據處理

將采集的質譜數據進行數據預處理，其中包括去卷積、校準、峰對齊、峰提取，獲取數據矩陣。將處理的數據矩陣導入SIMCA-P 14.1(Umetrics，ume?，Sweden) 軟件，對數據矩陣歸一化、標準化處理，分別進行PCA無監督分析、正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統計分析。OPLS-DA分析中根據變量VIP(對分組貢獻值)的大小(VIP> 1，規格化方法為Par)和組間變化的顯著性(P<0.05)進行黃芩產地間差異性代謝產物篩選。

3 結果

3.1 黃芩代謝物的鑒定

MassBank數據庫結合文獻報道[1]，根據化學成分的保留時間、質荷比及碎片離子信息對黃芩成分結構進行指認，共推斷鑒定出25個化合物，詳見表2。

表2 黃芩成分鑒定結果

3.2 主成分分析(PCA)

圖1 不同產地黃芩樣品PCA得分圖

圖2 不同產地黃芩樣品PCA荷載圖

3.3 河北承德與山西聞喜黃芩樣品代謝差異物分析

圖3 兩產地黃芩OPLS-DA得分圖

圖4 Permutation Test

3.2.2 差異物分析 采用OPLS-DA模型VIP值(VIP>1)，并結合t檢驗(t-test)的P值(P<0.05)來尋找差異性表達代謝物。如表3所示，共篩選出4種差異代謝差異物，山西聞喜黃芩中Oroxylin A-7-O-glucuronopyranoside量高于河北承德，其余3個代謝產物均低于河北承德黃芩。

表3 兩產地黃芩樣品差異代謝物鑒定結果

3.4 河北承德與陜西澄城黃芩樣品代謝差異物分析

圖5 兩產地黃芩OPLS-DA得分圖

圖6 Permutation Test

3.2.4 代謝差異物分析 采用OPLS-DA模型VIP值(VIP>1)，并結合t檢驗(t-test)的P值(P<0.05)來尋找差異性表達代謝物。如表4所示，共篩選出9種差異代謝差異物，陜西澄城黃芩中Trihydroxy-monomethoxyflavone、Tenaxin I倍性變化高于河北承德，其余7個代謝產物均低于熱河黃芩。

表4 兩產地黃芩樣品差異代謝物

4 討論

黃芩作為中醫寒涼藥的代表具有很高藥用價值和經濟價值。植物化學研究表明黃芩含有黃酮類、揮發性油、萜類、多糖等多種化學成分[2-4]，而黃酮類成分被認為是黃芩中特征性成分。現代藥理研究黃芩廣泛的藥理活性，具有神經保護作用、抗炎、保肝作用、抗腫瘤、抗菌、抗氧化對免疫系統的作用、對肝臟的保護作用、抗腫瘤作用、抗菌抗病毒作用、抗氧化作用等藥理作用[5-11]。不同產地來源藥材化學組分存在差異性，對臨床藥效存在直接的影響。代謝組學是系統生物學的重要組成部分，其特點是以組群指標成分分析為基礎，高通量檢測方法和多元數據處理為手段。藥用植物中活性成分本質上為植物代謝產物，運用代謝組學技術對道地產區黃芩和其他產地黃芩組分分析有利于黃芩資源評價。本研究以道地產區熱河黃芩為控制組，與其他產地黃芩進行代謝組進行比較分析，通過主成分分析可以清晰判別不同產地黃芩，OPLS-DA分析篩選出熱河黃芩與與其他產地黃芩差異代謝物，為不同產地黃芩物質表征及黃芩品質評價提供了科學依據。