富氫水對小鼠膿毒癥胰腺損傷的改善作用

李悅嫻，秦樹存，張錦△

膿毒癥是宿主對感染反應失調造成的一種嚴重全身炎癥反應綜合征，最終導致多器官功能衰竭和膿毒性休克［1］，是重癥感染死亡的主要原因。胰腺損傷是膿毒癥重要的器官功能障礙之一［2］。氫分子具有選擇性清除羥基自由基和過氧亞硝酸鹽陰離子的作用，是一種新型抗氧化劑，于2007 年被首次應用于醫療領域［3］。本課題組前期研究發現，氫分子可明顯改善膿毒癥誘導的肝損傷［4］、心功能障礙［5］和肺損傷［6-8］。氫分子對膿毒癥腎損傷亦有治療作用［9］，但對膿毒癥胰腺損傷是否有改善作用卻鮮見報道。本實驗通過脂多糖（LPS）尾靜脈注射建立小鼠胰腺損傷模型，觀察氫分子對膿毒癥胰腺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 LPS 購自美國Sigma-Aldrich 公司；富氫水（HRS）購自北京活力氫源公司；異氟烷購自深圳瑞沃德公司；無水乙醇、二甲苯、中性塑膠購自國藥集團化學試劑有限公司；HE 染液套裝購自武漢Servicebio 公司；淀粉酶檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6、髓過氧化物酶（MPO）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自武漢優爾生公司；包埋機JB-P5購自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機RM2016 購自上海徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡Eclipase E100、成像系統DS-U3購自日本尼康公司；低溫高速離心機3-18K購自德國SIGMA公司；酶標儀ELX 808購自美國Biotek公司。

1.2 動物模型制備及分組 SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠18只，體質量18～20 g，購自中國醫科大學實驗動物部。所有動物管理和手術操作均經中國醫科大學附屬盛京醫院醫學倫理委員會批準（倫理編號：2020PS701K）。小鼠飼養于標準化環境中，環境溫度為（24±2）℃，光照條件為12 h晝夜節律，可自由食用標準食物和飲水。

按隨機數字表法將C57BL/6J雄性小鼠分為對照組、模型組（LPS 組）和HRS 處理組（LPS+HRS 組），每組6 只。LPS 組和LPS+HRS 組小鼠給予尾靜脈單次注射LPS 5 mg/kg，建立胰腺損傷模型［8］，對照組小鼠尾靜脈給予相同劑量的生理鹽水。參考本課題組前期研究［5-6］，LPS+HRS 組小鼠在 LPS 給藥后1 h 給予10 mL/kg HRS 腹腔注射，對照組和LPS 組小鼠于相同時間點腹腔注射相同劑量的生理鹽水。

LPS 給藥后24 h，小鼠異氟烷麻醉后仰臥固定，乙醇消毒，經腹正中線剪開皮膚，暴露腹主動脈取血0.5 mL；而后脫頸處死小鼠，取胰腺組織。血液室溫自然凝固10～20 min，3 000 r/min離心20 min，吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存備用。胰腺組織一半完全浸泡于10%福爾馬林溶液，另一半于-80 ℃冰箱保存。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 小鼠行為學表現 LPS給藥后觀察各組小鼠精神狀態和活動狀況。

1.3.2 胰腺組織HE染色和改良Schmidt組織病理學評分 取經10%福爾馬林溶液固定后的胰腺組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，經70%、80%、90%和無水乙醇浸泡梯度脫水，純二甲苯透明后，進行石蠟包埋。包埋后切成5 μm厚切片，經脫蠟、復水后，蘇木素染色5～10 min，PBS洗滌，0.1%鹽酸乙醇分化液分化10 s，伊紅染色30 s～2 min，PBS洗去多余染液。經脫水、透明和中性塑膠封片后，置于顯微鏡下觀察。對Schmidt胰腺組織病理學評分［10］進行改良，從水腫、炎癥、出血和壞死4個方面對進行胰腺組織病理學量化評分［11］。將出血（實質出血面積）評分進一步改進為：0 分，無；1 分，≤25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%。

1.3.3 酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清淀粉酶、胰腺組織炎性因子、MPO和MDA水平 從-80 ℃冰箱取出小鼠血清和胰腺組織。胰腺組織用PBS沖洗后稱質量剪碎，按10%勻漿比例加入預冷的含蛋白酶抑制劑的PBS 勻漿。吸取勻漿液到離心管，4 ℃、5 000 r/min 離心5～10 min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作測定血清淀粉酶，胰腺組織TNF-α、IL-6、MPO和MDA水平。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較行Dunn’s 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠行為學表現 LPS給藥后10 h LPS組小鼠出現1 只死亡。因此，各組小鼠24 h 檢測數據樣本量均為5只。與對照組相比，LPS組小鼠表現為嗜睡、寒戰、行動遲緩，梳毛活動減少，并出現嚴重腹瀉。與LPS 組相比，LPS+HRS 組小鼠嗜睡和寒戰程度減輕、梳毛活動增加、腹瀉減輕、排泄物減少。

2.2 各組小鼠胰腺組織形態學變化 HE染色結果顯示，與對照組相比，LPS 組小鼠胰腺出現組織水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死，各項改良Schmidt組織病理學評分及總分升高（P＜0.05）；與LPS 組相比，LPS+HRS 組水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死程度和范圍明顯減輕，各項改良Schmidt組織病理學評分無明顯變化（P＞0.05），改良Schmidt 組織病理學評分總分降低（P＜0.05）；LPS+HRS組與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、表1。

Fig.1 HE staining of pancreatic tissues in the three groups of mice(×200)圖1 小鼠胰腺組織HE染色（×200）

Tab.1 Histopathological scores of pancreatic injury in the three groups of mice表1 各組小鼠胰腺損傷的組織病理學評分 ［n=5，分，M（P25，P75）］

2.3 各組小鼠血清淀粉酶變化 LPS組小鼠血清淀粉酶水平顯著高于對照組，LPS+HRS 組小鼠血清淀粉酶水平明顯低于LPS 組，但仍高于對照組（均P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum amylase level,IL-6 and TNF-α levels in pancreatic tissue between the three groups of mice表2 各組小鼠血清淀粉酶、胰腺組織IL-6和TNF-α水平比較 （n=5，）

Tab.2 Comparison of serum amylase level,IL-6 and TNF-α levels in pancreatic tissue between the three groups of mice表2 各組小鼠血清淀粉酶、胰腺組織IL-6和TNF-α水平比較 （n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.05

組別對照組LPS組LPS+HRS組F血清淀粉酶（U/L）551.80±26.10 2 627.00±186.40a 1 555.00±142.70ab 289.800＊＊IL-6（ng/L）9.15±0.59 27.81±0.93a 15.42±1.29ab 471.800＊＊TNF-α（ng/L）51.53±1.74 157.10±5.62a 96.07±4.82ab 728.500＊＊

2.4 各組小鼠胰腺組織炎性因子變化 LPS組小鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α水平均高于對照組，LPS+HRS 組小鼠胰腺組織中IL-6 和TNF-α 水平均低于LPS組，但仍高于對照組（均P＜0.05），見表2。

2.5 各組小鼠胰腺組織中MPO 和MDA 水平比較 LPS 組小鼠胰腺組織中MPO 和MDA 水平均高于對照組，LPS+HRS 組小鼠胰腺組織中MPO 和MDA 水平均低于LPS 組，但仍高于對照組（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of MPO and MDA levels in pancreatic tissues between the three groups of mice表3 各組小鼠胰腺組織MPO和MDA水平比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of MPO and MDA levels in pancreatic tissues between the three groups of mice表3 各組小鼠胰腺組織MPO和MDA水平比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與LPS組比較，P＜0.05

組別對照組LPS組LPS+HRS組F MPO（U/g）10.62±1.11 24.84±0.62a 16.05±5.18ab 27.180＊＊MDA（μmol/g）22.28±1.64 65.20±1.74a 42.82±1.66ab 815.700＊＊

3 討論

LPS注射是一種簡便可重復的標準化膿毒癥制模方式，廣泛應用于膿毒癥各種器官損害的研究。本研究采用LPS尾靜脈注射的方式成功建立了小鼠膿毒癥的胰腺損傷模型，膿毒癥小鼠出現嗜睡、寒戰和腹瀉等膿毒癥行為學表現。此外，本研究結果顯示，膿毒癥小鼠的胰腺組織學表現為水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死，各項改良Schmidt 組織病理學評分及總分、血清淀粉酶升高，與既往研究報道的膿毒癥胰腺損傷的病理改變一致［2，11］，提示在LPS誘導的膿毒癥中存在嚴重的胰腺損傷。

氫分子是自然界中最小的分子，可穿透細胞膜和細胞器膜，作用于細胞核和線粒體等其他藥物難以到達的靶點，可選擇性清除人體內有害的活性氧（ROS）而不干擾人體內正常的氧化還原反應，且終產物為水，無毒無害，因此被眾多學者應用于各種氧化損傷和炎癥相關疾病的治療研究中，包括膿毒癥器官損傷［12］、胰腺炎［13］、缺血再灌注損傷［14］、阿爾茨海默癥［15］和動脈粥樣硬化［16］等。HRS 是采用高壓物理溶解的方式制成的富含氫分子的水溶液。本研究結果顯示，HRS處理后小鼠的嗜睡、寒戰和腹瀉等行為學表現有所減輕，胰腺組織水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死程度降低、總改良Schmidt 組織病理學評分和血清淀粉酶水平降低，提示HRS可明顯改善內毒素誘導的小鼠胰腺損傷。與LPS 組相比，LPS+HRS 組小鼠胰腺組織水腫、炎性細胞浸潤、出血及壞死的各項改良Schmidt 組織病理學評分無明顯變化，推測可能是樣本量較小的原因；但改良Schmidt 組織病理學評分總分降低，改良Schmidt 組織病理學評分總分更能評價胰腺組織的整體損傷程度。

炎癥是膿毒癥的重要病理之一。LPS通過與脂多糖結合蛋白（LBP）結合形成LPS-LBP 復合物，活化Toll 樣受體4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）通路［17］，促進炎性因子釋放，造成級聯放大的炎癥反應，形成膿毒癥炎癥反應機制［18］。TLR4 亦存在于胰腺組織中［17，19］。研究發現，抑制 TLR4/NF-κB 通路介導的IL-6 和TNF-α 表達的升高從而降低炎癥反應可以改善LPS誘導的膿毒癥胰腺損傷［20］。本研究結果顯示，LPS 組小鼠胰腺組織中 IL-6 和 TNF-α 較對照組升高，HRS 顯著抑制了LPS 誘導的膿毒癥小鼠胰腺組織中IL-6和TNF-α表達的升高，提示HRS逆轉了介導膿毒癥胰腺損傷中的核心炎癥機制。MPO 常被用來評價中性粒細胞浸潤。既往實驗研究發現，在膿毒癥肺損傷［6］和胰腺炎［21］中 MPO 升高。在急性胰腺炎中，胰腺組織中的中性粒細胞可形成中性粒細胞胞外誘捕網（NETs），活化信號通路，參與炎癥反應［13］。本研究結果顯示，在膿毒癥胰腺損傷中同樣存在MPO升高，HRS處理后MPO的升高被明顯抑制，提示HRS可顯著改善膿毒癥胰腺組織中的中性粒細胞浸潤，從而抑制炎癥。此外，在胰腺炎中存在內源性ROS 生成增多導致的過氧化水平升高［22］。本研究用MDA 評價膿毒癥小鼠胰腺組織的氧化應激水平，結果顯示，LPS 組胰腺組織中MDA 水平較對照組升高，HRS 處理顯著降低了MDA 水平，提示HRS 可明顯改善膿毒癥胰腺組織的氧化應激損傷。同時，本研究結果顯示，HRS 處理后血清淀粉酶、胰腺組織IL-6、TNF-α、MPO 和MDA 水平仍高于對照組，提示單次10 mL/kg 劑量腹腔注射的HRS 并不能獨立用于治療膿毒癥胰腺損傷。

綜上所述，HRS 可通過抑制炎癥反應和降低氧化應激顯著改善內毒素誘導的小鼠膿毒癥胰腺損傷。HRS 具有溫和抗氧化，可穿透細胞膜和細胞器膜，以及抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗休克，調節多種分子通路和自噬等多種作用機制，且成本低廉等優點，故具有較好的研究和應用前景。本研究尚存在不足之處，如未對HRS 改善LPS 誘導的膿毒癥胰腺損傷的上下游信號通路進行探索，未設置膿毒癥胰腺損傷多時間點和HRS多劑量觀察，這將是本課題組下一步的研究方向。