孕晚期食源性抗生素暴露及健康影響分析

張亞偉， 李介巖， 趙 蓉， 郝文靜， 王 欣

首都醫科大學附屬北京婦產醫院產科，北京 100026

2012年起，歐美學者開始關注作為動物疾病治療及生長促進劑用途的抗生素，可通過食物鏈富集進入人體內，對于一些特殊人群，比如孕產婦及其嬰幼兒，可能會產生健康影響，特別是對新生兒腸道菌群定植過程可能產生影響[1-5]。此后，國內外學者針對人群食源性抗生素暴露的影響也進行了相關研究[6-11]。在此基礎上，本研究以在首都醫科大學附屬北京婦產醫院進行產檢的孕晚期孕婦及其新生兒作為研究對象，通過對孕晚期孕婦血清、臍帶血清及其新生兒胎便的食源性抗生素暴露情況進行分析，探討生命體早期食源性抗生素暴露對新生兒腸道菌群的影響，為今后在圍產領域進行相關防治工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月至12月于首都醫科大學附屬北京婦產醫院產檢的孕晚期(≥36周)孕婦及其新生兒，共計94例，其中樣本收集完整病例共86例。納入標準：規律產檢的孕婦(≥36周)及其新生兒；同意本研究知情告知內容。排除標準：入組前2個月內接受過臨床抗生素治療。本研究經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會批準(2018-KY-025-02)，所有孕產婦均知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標 回顧性收集孕晚期孕婦臨床資料，包括年齡、孕周、孕次、分娩方式、產時抗生素使用情況等。

1.3 分組依據 新生兒的臍帶血被認為是研究環境相關新生兒疾病較好的生物材料，可準確反映胎兒在宮內的化學物累積接觸情況，相關數據可用于評估新生兒化學物暴露的健康風險。根據分娩后新生兒臍帶血樣本的抗生素暴露情況，將其分為對照組(n=43)和抗生素暴露組(n=43)。

1.4 檢測樣本 (1)母體血清樣本取自孕晚期(孕36周及以上)孕婦靜脈血；(2)臍帶血清樣本在新生兒斷臍后15 min之內采集；(3)胎便樣本在新生兒分娩之后48 h內采集。

1.5 檢測方法 采用超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-high performance liquid chromatography- mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS)和時間分辨熒光免疫層析法(time resolved fluorescent immunochromatography assay，TRFIA)檢測孕婦血清、臍帶血清、胎便中β-內酰胺類、氟喹諾酮類、磺胺類、四環素類、酰胺醇類和林可酰胺類六大類抗生素(共計50種)的暴露情況。這些抗生素均在國內經濟動物養殖過程中常用，包括32種獸用抗生素(veterinary antibiotics，VAs)，9種獸用/臨床通用抗生素(human/veterinary antibiotics，H/VAs)和9種臨床用抗生素(human antibiotics，HAs)。通過16S rRNA二代測序分析新生兒腸道菌群結構。孕婦靜脈血、臍帶血及新生兒胎便樣本的抗生素檢測由上海溯源生物技術有限公司完成；新生兒胎便樣本的腸道菌群檢測由卡尤迪生物科技有限公司完成。

1.5.1 UPLC-MS/MS法 UPLC-MS/MS采用Waters公司型號為ACQUITY UPLCH-Class FTN，Xevo TQD的檢測設備。抗生素標準物質采購自中國藥品生物制品檢定所。

取150 μL血清樣本，加入150 μL的4%磷酸溶液，漩渦混勻1 min，取混合液200 μL加入到Oasis HLB μElution Plate小孔中進行固相萃取。上樣前，SPE小孔依次用200 μL甲醇和200 μL水(2次，共400 μL水)活化平衡；上樣后用100 μL水沖洗2次后再用抽濾裝置抽干小孔。樣本孔用50 μL、60%乙腈洗脫并抽濾2次至抽干；用96孔收集板收集2次洗脫液，上機待測。

1.5.2 液相條件 色譜柱采用ACQUITY UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1×100 mm，美國Waters公司)；柱溫40℃，進樣量5 μL，樣品室溫度10℃。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇；流速0.4 mL/min。

1.5.3 質譜條件 采用電噴霧離子源正負離子(ESI+/ESI-)切換模式，多反應監測(MRM)方式采集分析，毛細管電壓分別為3.0 kV+/2.5 kV-，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為550℃，脫溶劑氣流速為1 000 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。

1.5.4 TRFIA法 抗生素檢測試劑盒均由上海溯源生物技術有限公司生產，配套使用上海溯源生物技術有限公司生產的SS-030型時間分辨熒光免疫分析儀，抗生素標準物質采購自中國藥品生物制品檢定所。

取150 μL稀釋液加入樣本杯，吸打混勻3～5次，再加入10 μL血清樣本，吸打混勻3～5次，插入檢測條，等待反應6 min，取出檢測條，將其插入時間分辨熒光免疫分析儀中讀數。

1.5.5 新生兒腸道菌群檢測 新生兒分娩之后48 h內采集新鮮胎便至特定樣本采集管。由卡尤迪生物科技有限公司利用16S rRNA二代測序平臺lllumina MiSeq對胎便進行檢測及分析。分別對對照組和抗生素暴露組胎便進行腸道菌群α-多樣性分析(包括豐度指數、香農指數、深度指數、物種信息指數)和多種屬水平的比較。

2 結 果

2.1 一般資料分析 結果(表1)顯示：共完整收集86例孕晚期孕婦樣本，年齡24～39歲，孕周36～41周。對照組和抗生素暴露組孕婦的年齡、孕周、孕次、分娩方式差異無統計學意義。

2.2 孕婦血清、臍帶血清和新生兒胎便中6類抗生素暴露情況 結果(表2～4)顯示：在排除臨床用藥后，2種檢測方法(UPLC-MS/MS法和TRFIA法)均提示孕晚期孕婦血清、臍帶血清、胎便樣本中抗生素呈現高比例暴露，甚至包括孕期禁用、慎用藥物，且在臍帶血抗生素的暴露比例高于孕婦血清。

表1 2組孕婦一般資料分析

表3 臍帶血清中6類抗生素暴露情況 n(%)

2.3 新生兒腸道菌群檢測結果 結果(圖1、圖2)顯示，對照組和抗生素暴露組的新生兒腸道菌群差異有統計學意義(P<0.05)。抗生素暴露使出生后新生兒腸道菌群的α-多樣性降低。抗生素暴露使原本屬于優勢菌群的糞桿菌屬(Faecalibacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)數量顯著減少，而鏈球菌屬(Streptococcus)占據優勢。

表4 新生兒胎便中6類抗生素暴露情況 n(%)

圖1 2組新生兒腸道菌群α-多樣性分析

圖2 2組新生兒腸道菌群屬水平差異

3 討 論

19世紀70年代開始，隨著抗生素制造工業的飛速發展，抗生素的應用拓展到了畜禽養殖領域。在動物養殖過程中，抗生素作為生長促進劑在加快動物生長和增產方面都起到了重要作用[12]。但由于抗生素應用時間的延長、應用范圍的擴大及抗生素殘留等多種因素，抗生素暴露對人群健康的影響引起研究者的廣泛關注。聯合國糧農組織/世界衛生組織(FAO/WHO)在20世紀90年代就基于細胞毒理學實驗、動物實驗、離體微生物實驗以及人體研究證據對食源性抗生素進行評價并發布可接受的每日攝入量(acceptable daily intake，ADI)[13]。近階段研究[14-17]結果提示，諸如抗生素殘留等環境污染物的低劑量持續暴露也可能對于生命體早期生長發育產生影響。復旦公共衛生學院研究[18]發現，青少年兒童體內抗生素暴露已成為公共衛生問題，是促進其脂肪生成的重要因素之一。美國紐約大學醫學院[1]通過一系列實驗證實低劑量抗生素的持續性暴露干預了生命體早期的發育，部分抗生素的影響是終生的、不可逆的。Leclercq等[19]研究發現，抗生素甚至會對行為和腦神經化學造成長期影響。

本研究的研究對象來自首都醫科大學附屬北京婦產醫院產科規律產檢的孕晚期妊娠婦女，在排除臨床用藥后，孕晚期孕婦血清抗生素呈現高比例暴露，甚至包括孕期禁用、慎用藥物，其來源推測以食物攝入為主。同一抗生素暴露在孕婦的不同樣本中，可進入胎兒循環。而且臍帶血中抗生素的暴露比例高于孕婦血清，可能與胎兒器官發育不完全，這些物質進入胎兒循環后無法代謝有關。

另外，學者們[20]發現食源性抗生素的低劑量、持續性暴露模式有別于臨床抗生素藥物的高劑量、短期暴露，而且食源性抗生素的這種低劑量、持續暴露模式更多是通過間接影響人體腸道菌群進而影響人體健康。已發表文獻[1-4]亦指出，低劑量抗生素的持續暴露對于生命體早期人群(胎兒、嬰幼兒)的影響主要是通過影響孕晚期孕婦腸道菌群結構，以及新生兒腸道菌群的定植，從而造成嬰兒腸道菌群成熟延遲、代謝系統紊亂、免疫系統異常，導致其發生肥胖、過敏等。本研究顯示，抗生素暴露組和對照組的新生兒腸道菌群存在顯著差異。抗生素暴露使新生兒腸道菌群的α-多樣性降低，且使原本屬于優勢菌群的糞桿菌屬和瘤胃球菌屬數量顯著減少，而鏈球菌屬占據優勢。這一結果表明，食源性抗生素暴露對新生兒腸道菌群結構造成了影響。

綜上所述，食源性抗生素可通過母體間接影響新生兒腸道菌群，進而影響嬰幼兒健康。這一結論給臨床提出了新的挑戰，如何有效干預食源性抗生素暴露對生命體早期人群(胎兒、嬰幼兒)的影響；進行孕晚期血清抗生素檢測，篩查陽性暴露人群，并對該人群實施醫療干預(如飲食調整、益生菌的補充)是否可行，均需進一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。