miR-103b調控ING5表達對急性淋巴細胞白血病細胞增殖和凋亡的影響

劉慧 張虹麗 田姍

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是常見的兒童惡性疾病，發病率呈增長趨勢[1]。近年來，隨著醫療水平的進步，盡管ALL患者5年生存率明顯提高，但仍有部分患兒治療療效不佳[2]。目前，ALL發生發展的機制仍未闡明，深入研究影響ALL發生發展的分子機制對其治療靶點的選擇具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為18～25個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA，可與靶信使RNA(mRNA)的3’非翻譯區(3’untranslated region，3’UTR)靶向結合，抑制靶mRNA的翻譯或降解靶mRNA，從而在轉錄后水平調控靶基因的表達，在血液系統疾病中發揮重要作用[3]。研究顯示，miR-103b在ALL患者中表達升高，可作為臨床診斷該疾病的潛在分子標志物[4]。但是，miR-103b對ALL細胞增殖和凋亡的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，生長抑制蛋白家族成員5(inhibitor of growth family member 5，ING5)可能是miR-103b的靶基因。ING5基因定位于染色體2q37.3，具有抑制細胞生長并誘導細胞凋亡的作用，是一種抑癌基因。研究顯示，ING5過表達可抑制胃癌[5]、甲狀腺癌[6]、食管鱗狀細胞癌[7]等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學行為，發揮抗腫瘤作用。目前，ING5對ALL細胞增殖和凋亡的影響也還未知。本研究以急性T淋巴細胞白血病細胞Molt4為研究對象，主要探討了miR-103b對Molt4細胞增殖和凋亡的影響及其是否通過調控ING5表達影響Molt4細胞的增殖和凋亡，以期為進一步闡明ALL發生發展的分子機制及治療靶點的尋找提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2018年10月于西安交通大學附屬三二○一醫院確診并治療的37例ALL患兒為ALL組，其中男21例，女16例；年齡3～12歲，平均年齡(7.23±2.15)歲。另選取同時期16例血小板減少癥患兒為對照組，其中男9例，女7例；年齡5～10歲，平均年齡(6.89±2.57)歲。取2組患兒骨髓標本5 ml，加入等體積PBS稀釋后，使用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次，-80℃保存備用。本研究經本院倫理委員會批準同意，患者家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 細胞與主要試劑 急性淋巴細胞白血病細胞Molt4(中國科學院上海細胞庫)，胎牛血清(fet al bovine serum，FBS)和RPMI 1640培養基(美國Gibco公司)，四甲基噻唑藍(methylthiazoletrazolium，MTT)和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)，Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒(美國Invitrogen公司)，miR-103b抑制劑、模擬物(mimics)及陰性對照、ING5小干擾RNA(si-ING5)及亂序無意義陰性序列(si-NC)(上海吉瑪制藥技術有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，雙熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)，細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Molt4細胞培養:復蘇Molt4細胞后，加入含10% FBS的RPMI 1640培養基，置于培養箱(37℃、5%CO2、97%濕度)中培養。每2～3天更換1次新鮮培養基。當細胞融合至80%～90%時，吸棄培養基，加入預冷的PBS清洗細胞。吸棄PBS后，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，顯微鏡下觀察細胞形態為圓形時，加入含 FBS的RPMI 1640培養基終止消化，進行傳代培養。

1.3.2 Molt4細胞轉染和分組:將對數生長期的Molt4細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞。當細胞融合至60%時，參照LipofectamineTM 2000試劑盒操作說明書，分別將miR-103b抑制劑(anti-miR-103b組)及陰性對照(anti-miR-NC組)、miR-103b mimcs(miR-103b 組)及陰性對照(miR-NC組)、miR-103b抑制劑與si-ING5(anti-miR-103b+si-ING5組)、miR-103b抑制劑與si-NC(anti-miR-103b+si-NC組)轉染至Molt4細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養基。繼續培養至48 h后，收集細胞，實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測細胞中miR-103b水平評價轉染效果。

1.3.3 RT-qPCR檢測miR-103b表達水平:Trizol試劑盒提取骨髓單個核細胞或Molt4細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度。然后參照逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。并以cDNA為模板，進行擴增。擴增程序為95℃預變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環。引物序列miR-103b上游5’-GAGCAGCATTGTACAG-3’，下游5’-GTGCAGGGTCCGAGG T-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGGGACA-3’，下游5’-AACGGTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-103b相對表達水平。

1.3.4 MTT檢測細胞增殖:轉染后的2組細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞。培養箱中培養48 h后，每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續孵育4 h。吸棄培養基，加入150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標儀490 nm處測定吸光度值(absorbance，A)。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡:2組轉染后的Molt4細胞接種于24孔板中，每孔1×104個細胞。培養箱中培養48 h后，吸棄培養基，加入適量0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。取1.0×106個細胞，PBS清洗2次。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說明書，加入400 μl結合緩沖液，輕輕吹打，混懸細胞。依次加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育10 min。再加入100 μl結合緩沖液，渦旋混勻后，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 蛋白印跡(Western Blot)法檢測CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表達:轉染后的各組細胞培養48 h后，收集細胞，PBS清洗2次。吸棄PBS，細胞中加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上充分裂解，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔蛋白上樣量為30 μg。電泳結束后，濕轉至聚偏乙烯二氟膜。轉膜后，置于5%脫脂牛奶中封閉2 h。分別加入CyclinD1(稀釋度1∶600)、P21(稀釋度1∶400)、Bcl-2(稀釋度1∶400)和Bax(稀釋度1∶400)抗體，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標記的二抗(稀釋度1∶200)，37℃孵育1 h。滴加ELC顯影液，避光顯影后凝膠成像系統曝光拍照。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-103b和ING5靶向關系:生物信息學軟件預測顯示，ING5的3’UTR存在與miR-103b核苷酸序列結合的位點。PCR擴增含miR-103b結合位點的ING5的3’UTR序列，構建ING5野生型質粒(WT-ING5)和突變型質粒(MUT-ING5)。分別將WT-ING5、MUT-ING5與miR-103b mimic、陰性對照共轉染至Molt4細胞。轉染12 h后，更換新鮮培養基。繼續培養至48 h，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性，以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示各組的熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-103b在急性淋巴細胞白血病患者骨髓中的表達 與對照組比較，白血病患者骨髓中miR-103b表達水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 miR-103b在急性淋巴細胞白血病患者骨髓中的表達

2.2 抑制miR-103b對Molt4細胞增殖和凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-103b組Molt4細胞中miR-103b水平降低(P<0.05)，說明miR-103b抑制劑轉染成功，Molt4細胞中miR-103b表達受到抑制。與nti-miR-NC組比較，anti-miR-103b組細胞存活率、Cyclin D1和Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，細胞凋亡率、P21和Bax蛋白水平升高(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 抑制miR-103b對Molt4細胞增殖和凋亡的影響;A 抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡的影響；B 抑制miR-103b對Molt4細胞增殖、凋亡蛋白表達的影響

表2 抑制miR-103b對Molt4細胞增殖的影響

表3 抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡的影響

2.3 miR-103b靶向調控ING5表達 生物信息學軟件預測顯示，ING5的3’UTR含有與miR-103b互補的核苷酸序列。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-NC組比較，miR-103b組共轉染WT-ING5的熒光素酶活性降低(P>0.05)，而共轉染MUT-ING5的熒光素酶活性物明顯變化(P>0.05)，說明miR-103b可與ING5的3’UTR靶向結合。miR-103b組ING5蛋白水平低于miR-NC組(P>0.05)，anti-miR-103b組ING5蛋白水平高于anti-miR-NC組(P>0.05)，進一步說明miR-103b靶向負調控ING5表達。見圖2，表4、5。

表4 雙熒光素酶實驗結果

圖2 miR-103b靶向調控ING5表達;A ING5的3’UTR含有miR-103b的互補序列；B miR-103b調控ING5的表達

2.4 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞增殖的抑制作用 與anti-miR-103b+si-NC組比較，anti-miR-103b+si-ING5組Molt4細胞中ING5蛋白水平降低(P<0.05)，說明ING5小干擾RNA轉染成功，Molt4細胞中ING5表達受到抑制。與anti-miR-103b+si-NC組比較，anti-miR-103b+si-ING5組細胞存活率、Cyclin D1蛋白水平升高(P<0.05)，P21蛋白水平降低(P<0.05)。見圖3，表6。

表5 miR-103b調控ING5的表達

圖3 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞增殖蛋白表達的影響

表6 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞增殖的影響

2.5 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡的促進作用 與anti-miR-103b+si-NC組比較，anti-miR-103b+si-ING5組細胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表7，圖4。

表7 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡的影響

圖4 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡的影阿響;A 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡的影響；B 抑制ING5能逆轉抑制miR-103b對Molt4細胞凋亡蛋白表達的影響

3 討論

ALL是一種血液系統疾病，其顯著特征是細胞過度增殖和凋亡抑制[8]。因此，抑制ALL細胞的異常增殖并誘導細胞凋亡可延緩該疾病的發展進程。miRNA參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等生命過程，是血液系統疾病、腫瘤等疾病的潛在治療靶點[9,10]。探討ALL患者體內異常表達的miRNA及miRNA對ALL細胞增殖、凋亡的影響和作用機制，對于ALL疾病發生發展機制的闡明和治療靶點的尋找提供新思路。

miR-103b是近幾年新發現的一種miRNA。黃耿等[11]研究顯示，miR-103b可通過激活腎癌細胞中P21蛋白的表達，阻滯腎癌細胞周期的進展，抑制腎癌細胞的生長。目前，miR-103b對ALL細胞生物學行為的影響還未知。本研究顯示，miR-103b在ALL患者骨髓中表達升高，提示miR-103b可能參與ALL疾病的發生發展。通過轉染miR-103b抑制劑至Molt4細胞后，Molt4細胞存活率降低，凋亡率升高，說明抑制miR-103b表達可抑制Molt4細胞增殖，并誘導細胞凋亡。Cyclin D1是細胞周期關鍵調控蛋白之一，可促進G1期向S期轉變，加速細胞增殖[12]。P21是腫瘤生長抑制因子，其表達升高可抑制腫瘤發展。本研究顯示，抑制miR-103b表達后，Molt4細胞中Cyclin D1蛋白表達降低，而P21蛋白表達升高，提示抑制miR-103b表達通過調控Cyclin D1和P21蛋白表達抑制Molt4細胞增殖。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在細胞凋亡過程中發揮重要作用，Bcl-2表達升高抑制細胞凋亡，而Bax表達升高則促進細胞凋亡[13]。本研究顯示，抑制miR-103b表達后，Molt4細胞中Bcl-2蛋白表達降低，而Bax蛋白表達升高，提示抑制miR-103b表達通過調控Bcl-2和Bax蛋白表達誘導Molt4細胞凋亡。

為了進一步探討miR-103b影響ALL細胞增殖和凋亡的作用機制，本研究通過生物信息學軟件預測顯示，ING5可能是miR-103b的靶基因。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，miR-103b可與ING5的3’UTR靶向結合。此外，上調Molt4細胞中miR-103b表達后，ING5蛋白水平降低，而下調miR-103b表達后，ING5蛋白水平升高，證實了miR-103b在Molt4細胞中靶向負調控ING5表達。ING5是生長抑制蛋白家族成員成員之一，參與調控細胞生長、凋亡等生物學行為，已被證實在腫瘤中發揮抗腫瘤作用。Liu等[14]研究顯示，ING5過表達可通過抑制WNT/β-catenin途徑抑制肺癌的侵襲和上皮間質轉化。Xie等[15]研究顯示，miR-181b通過靶向下調ING5表達促進肝癌細胞的增殖，影響肝癌發展進程，miR-181b/ING5軸為肝癌的靶向治療提供了新途徑。宋洋等[16]研究顯示，ING5過表達可抑制乳腺癌Bcap-37細胞的增殖和遷移，并誘導細胞周期G2期阻滯和細胞凋亡，ING5可作為乳腺癌基因治療的分子靶標。這些研究均說明了ING5基因在腫瘤中發揮抗腫瘤作用，通過上調ING5表達可抑制腫瘤發展進程，為腫瘤治療靶點的選擇提供了新思路。目前，ING5在ALL疾病中的作用還未知。本研究顯示，抑制ING5表達逆轉了抑制miR-103b表達對Molt4細胞增殖和凋亡的影響，提示miR-103b通過靶向上調ING5表達抑制Molt4細胞增殖，并誘導細胞凋亡，是治療ALL疾病的潛在分子靶點。

綜上所述，抑制miR-103b表達可抑制ALL細胞增殖，應誘導細胞凋亡，其可能通過靶向上調ING5表達發揮作用，miR-103b/ING5軸為ALL疾病的靶向治療提供了新途徑。