藜麥甾醇提取工藝優化及脂肪酸組成分析

劉雅謙，李琳，孫萬成，羅毅皓

（青海大學農牧學院，青海 西寧 810016）

藜麥（Chenopodium quinoa）是一種古老的假谷物，屬于黎科，主要分布在我國的甘肅、青海、內蒙古等地。藜麥富含蛋白質、脂類、纖維素、維生素和礦物質，對極端的環境條件有很好的適應性[1-2]，已有大量的研究報道了藜麥的營養價值，但對于藜麥油脂的研究較少見。研究表明[3]，藜麥油脂中包含大量的生物活性化合物（包括棕櫚酸、長鏈脂肪酸、植物甾醇、角鯊烯），可應用于功能性食品開發[4]。

植物甾醇（phytosterol，PS）是植物細胞膜的重要結構成分，被譽為“生命的鑰匙”，已有大量的報道[5]證明植物甾醇具有降低低密度脂蛋白膽固醇的特性。近年來對于藜麥具有的抗氧化[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]及促進動物生長[9]等功能特性也相繼被證實。目前提取植物甾醇的方法，提取率相對較低且溶劑耗費較大，如溶劑提取法、超聲波輔助提取法和皂化法等。

超臨界CO2提取技術可以排除殘留液體溶劑的污染，且具有更高的擴散率（10-4cm2/s）[10]，對于親脂性化合物有更高的親和力[11]。超臨界CO2提取技術通過改變溫度和壓力來調節溶劑溶解力，以獲得高純度的脂質；通過降低壓力將溶解的溶質從CO2中分離出來[12]。華正根等[13]從靈芝中提取三萜和甾醇成分，發現超臨界CO2萃取法的提取效果顯著大于乙醇回流法。超臨界CO2萃取法適用于大規模提取不同類型的基質，用于生產食品、藥品、化妝品和其它高價值的脂質和生物活性物質[14]。目前有關超臨界CO2-皂化法協同輔助提取植物甾醇的研究鮮有報道。因此本試驗探究超臨界CO2法和皂化法協同提取藜麥甾醇的工藝條件，并對藜麥油脂中的脂肪酸進行成分分析，以期為藜麥資源的深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

藜麥：市售；β-谷甾醇標準品（≥98%）:北京世紀奧科生物技術有限公司；三氯化鐵（FeCl3·6H2O）、濃磷酸、濃硫酸、無水乙醇、正己烷、甲醇、三氟化硼:天津巴斯夫化學試劑有限公司；無水硫酸鈉、氫氧化鉀:唐山三孚硅業股份有限公司；二氧化碳（純度＞99.99%）:西寧磊豪商貿有限公司；所有試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

超臨界萃取裝置（Spe-ed SFE-NP）：上海帝博思生物科技有限公司；可見分光光度計（722N）：上海佑科儀器儀表有限公司；電熱鼓風干燥箱（DGX-9073B）：上海南榮實驗室設備有限公司；氮吹儀（DN-12A）：上海比朗儀器制造有限公司；氣質聯用儀（TSQTM9000）：賽默飛世爾科技有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州金壇良友儀器有限公司；旋轉蒸發儀（RE-2000A）：濟南歐萊博科學儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機（TCL-16M）：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藜麥甾醇的提取

將藜麥清洗除雜，烘箱干燥后，粉碎機粉碎，過40目篩。準確稱取30 g藜麥粉置于超臨界CO2萃取釜中，在一定的壓力和溫度下萃取一段時間后得到藜麥油脂，將藜麥油脂進行離心，離心后的上清液放入具塞試管中，加入2 mol/L KOH-乙醇溶液，在70℃水浴鍋內進行皂化2 h，冷卻后，將其轉移至分液漏斗，加入正己烷，振搖數分鐘，將正己烷層取出，旋轉蒸發正己烷，用無水乙醇溶出，最終定容至10 mL。以備藜麥甾醇含量的測定。以萃取溫度、萃取時間、萃取壓力為因素，考察不同條件下藜麥甾醇得率。

1.2.2 單因素試驗

本研究以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間為單因素進行試驗，并計算藜麥甾醇的得率，確定最優工藝條件。單因素試驗水平參照文獻[17]設計，CO2流量控制為5 mL/min。固定條件：萃取壓力25 MPa，萃取溫度50℃，萃取時間2 h，選取一個因素為變量，固定另外兩個條件。分別考察不同萃取壓力（15、20、25、30、35 MPa）、不同萃取溫度（40、45、50、55、60 ℃）、不同萃取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對藜麥甾醇得率的影響。

1.2.3 正交試驗

在超臨界CO2-皂化法提取藜麥甾醇單因素試驗基礎上,設計三因素三水平L9（33）正交試驗表來確定藜麥甾醇提取的最佳方案。試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factor level of orthogonal test

1.2.4 藜麥甾醇得率的測定

精確稱取5 mL的藜麥甾醇提取物樣品溶液，用無水乙醇進行稀釋，利用硫磷鐵法檢測樣品溶液，在530 nm處測定吸光值，配制一系列濃度梯度β-谷甾醇溶液，繪制吸光度-β-谷甾醇濃度標準曲線，利用回歸方程求出藜麥甾醇的質量濃度，具體方法見參考文獻[15]，計算公式如下。

式中：X為藜麥甾醇得率，mg/g；C為提取液吸光度對應甾醇標準溶液質量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；B為稀釋倍數；M為藜麥油脂的質量，g。

1.2.5 氣相色譜串聯質譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）前處理及分析

GC-MS前處理及分析參考文獻[16]中的方法。

1.2.6 數據分析

試驗數據采用IBM SPSS Statistics 23軟件和Excel軟件進行數據處理與分析。每個樣品重復測定3次，數據用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 β-谷甾醇標準曲線

β-谷甾醇標準曲線見圖1。

圖1 β-谷甾醇標準曲線Fig.1 The standard curve of β-sitosterol

由圖1得到回歸方程y=15.564x-0.003 8，相關系數R2為0.999，根據方程可知β-谷甾醇標準曲線的回歸性較好，可進行定量分析。

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 萃取壓力對藜麥甾醇提取效果的影響

不同萃取壓力對藜麥甾醇得率的影響見圖2。

圖2 不同萃取壓力對藜麥甾醇得率的影響Fig.2 Effect of different extraction pressure on the yield of quinoa sterol

由圖2可知，藜麥甾醇得率隨著萃取壓力的增加呈現出先上升后下降的趨勢。隨著萃取壓力的增大，藜麥甾醇得率逐漸提高，這可能是由于壓力的增加導致CO2的密度增大，被萃取物的溶解度增加，在壓力為25 MPa時，藜麥甾醇得率達到最大值，為19.56 mg/g。但當壓力繼續增高，藜麥甾醇得率開始下降，可能是由于隨著萃取壓力的增加，CO2氣體的擴散系數下降，從而不利于藜麥甾醇的提取。因此選擇萃取壓力為25 MPa。

2.2.2 萃取溫度對藜麥甾醇提取效果的影響

萃取溫度也是影響超臨界CO2萃取能力的主要因素之一。系統溫度的升高會降低CO2的密度，這可能導致溶劑的溶解能力降低[18]。另一方面，溫度升高會增加擴散率和蒸汽壓力，從而有助于分子輕松釋放到溶劑中。因此，施加溫度的凈效應取決于分子蒸汽壓和萃取劑密度的變化[19]。不同萃取溫度對藜麥甾醇得率的影響見圖3。

圖3 不同萃取溫度對藜麥甾醇得率的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on the yield of quinoa sterol

由圖3可知，在40℃～50℃范圍內，隨著溫度的升高，藜麥甾醇得率逐漸增加。在50℃時達到最大值，為19.44 mg/g。在50℃～60℃范圍內，隨著溫度繼續升高，藜麥甾醇得率開始下降，此階段可能是CO2密度起主要作用。因此選取萃取溫度為50℃。

2.2.3 萃取時間對藜麥甾醇提取效果的影響

不同萃取時間對藜麥甾醇得率的影響見圖4。

圖4 不同萃取時間對藜麥甾醇得率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on the yield of quinoa sterol

由圖4可知，萃取時間在1.0 h～2.0 h內，隨著萃取時間的延長，藜麥甾醇得率逐漸增加，2.0 h后保持穩定，分析原因可能是，在1.0 h～2.0 h內，CO2流體逐漸進入到物料中，并將物料內成分溶解，最后通過強大的氣流將藜麥甾醇萃取出來，當時間到達2.0 h時，藜麥甾醇幾乎全部被萃取出，考慮到過高的時間浪費成本，因此選取萃取時間為2.0 h。

2.3 正交試驗分析

根據單因素試驗結果確定出超臨界CO2-皂化法提取藜麥甾醇的適宜條件為：萃取壓力25 MPa，萃取溫度50℃，萃取時間2 h，在此基礎上以藜麥甾醇得率為評價指標進行正交試驗。正交試驗結果見表2，正交試驗中各檢測指標方差分析結果見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 藜麥甾醇得率方差分析Table 3 Variance analysis of quinoa sterol extraction rate

由表2分析可知，根據K1、K2、K3可以確定出萃取藜麥甾醇的最優試驗組合為A2B2C3，即萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50℃，萃取時間為2 h。這3個因素對藜麥甾醇得率的影響大小順序為：A＞C＞B，即萃取壓力＞萃取時間＞萃取溫度。按照最優的工藝進行驗證試驗，平均操作3次，藜麥甾醇的得率為20.20 mg/g。此時藜麥甾醇的得率最高，與正交試驗優化出的結果相同，表明該工藝的穩定可行。李會珍等[20]采用超聲波輔助萃取法提取紫蘇中的甾醇，最終紫蘇甾醇得率可達2.604 mg/g。李波等[21]采用微波輔助提取法提取大豆油中植物甾醇，提取率可達到36.22%。還有研究表明[22]利用皂化-超聲波法提取玉米須中的植物甾醇，得率可達10.588 6 mg/g。馬永芹[23]利用超臨界CO2萃取米糠甾醇油，在最佳的工藝條件下制取米糠油中甾醇含量為2.274%，研究結果的不盡相同可能與原料中甾醇的含量以及提取方法的不同有關。本試驗利用超臨界CO2-皂化法提取藜麥中的甾醇，藜麥甾醇的得率相對較高，該提取方法可能優于超聲波輔助提取法和微波輔助提取法。

F檢驗結果表明，萃取壓力、萃取溫度和萃取時間對藜麥甾醇得率的影響有顯著性差異（p＜0.05）。

2.4 氣相色譜-質譜檢測

利用GC-MS對藜麥油脂進行成分分析，得到藜麥油脂的色譜圖見圖5，脂肪酸組成成分分析見表4。

表4 藜麥油脂GC-MS成分分析Table 4 GC-MS analysis of components of quinoa oil

圖5 GC-MS色譜圖Fig.5GC-MS chromatogram

從表4中可以看出藜麥油脂中一共有29種脂肪酸，飽和脂肪酸的含量為25.59%，不飽和脂肪酸的含量為74.59%，單不飽和脂肪酸的含量為28.70%，多不飽和脂肪酸的含量為45.89%，超長鏈脂肪酸的含量為27.66%，支鏈脂肪酸的含量為0.63%。多不飽和脂肪酸中以常規的偶數碳脂肪酸為主。飽和脂肪酸中棕櫚酸的含量最高，不飽和脂肪酸中亞油酸含量最高。藜麥油脂中主要的脂肪酸為亞油酸、亞麻酸和油酸，棕櫚酸的含量相對較低，其中還檢測到二十烯酸和介酸，這與Chen等[3]對藜麥采用氣相色譜法分析的結果相似。亞油酸是藜麥油脂中含量最多的脂肪酸，Ryan等[25]利用溶劑提取法提取藜麥油脂，氣相色譜法測定藜麥油脂中脂肪酸，結果同樣發現亞油酸（48.07%）含量最高，其次是油酸（29.49%）和棕櫚酸（9.18%）含量較高，結果與本次研究結果有差異，可能與藜麥品種以及提油方法不同有關。另外，本次檢測結果中含有0.63%的支鏈脂肪酸，這是其他研究人員對于藜麥脂肪酸分析中尚未見報道的。

從表4中可以看到參考文獻[24]中研究人員對藜麥油脂脂肪酸檢測的結果，一共檢測出26種脂肪酸，檢測出的脂肪酸種類與本次研究結果相似，但也具有一定的差異，其中亞麻酸的含量為30.96%，亞油酸的含量為21.94%。棕櫚酸的含量為7.15%，超長鏈脂肪酸的含量為15.37%，而本次試驗檢測結果中亞油酸含量為25.03%，亞麻酸的含量為18.85%，棕櫚酸含量為7.96%，超長鏈脂肪酸含量為27.66%。該研究人員還檢測出了藜麥油脂中的反油酸以及二十碳五烯酸等，這些都是本次檢測所沒有檢測到的。這些檢測結果的差異可能與藜麥品種不同有關。該研究人員檢測的結果中ω-3∶ω-6脂肪酸為1.3，而本次研究結果為0.7。表明本次的研究結果中ω-6系列的脂肪酸相對含量較高。這兩種脂肪酸的平衡在人類飲食中很重要[26]。在現代人的飲食中，建議食用富含ω-3和ω-6系列脂肪酸的食物，因為這兩種必需脂肪酸在人體中不合成。

亞油酸是人體健康必不可缺的一種多不飽和脂肪酸，屬于ω-6系列，多數研究報道了亞油酸能夠降低低密度脂蛋白膽固醇，預防心血管疾病的發生[27-28]，是生產功能性食品補充劑的常用成分，還具有降低炎癥反應的作用，例如，Lowry等[29]研究證明了亞油酸通過降低一氧化氮合酶降低脂多糖刺激的BV-2小膠質細胞NO的釋放。亞麻酸屬于ω-3系列，ω-3脂肪酸可調節神經系統、血壓和發炎過程[30]，是人類健康飲食中不可或缺的一部分。亞麻酸能夠促進動物生長，增強免疫力和抗氧化能力，改善肉質并降低血脂[31]，可用作保健品和醫藥品。超長鏈脂肪酸是脂質介質的前體，也是細胞脂質如鞘脂和甘油磷脂的組成成分。油酸對人體也有一定的積極作用，膳食油酸對老年人的認知具有保護作用[32]。研究表明[33]，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸具有保護視網膜的潛力。

3 結論

本研究結合超臨界CO2-皂化法萃取技術，通過單因素試驗和正交試驗分析，得到超臨界CO2-皂化法萃取藜麥甾醇的最佳工藝條件，即萃取壓力為25 MPa，萃取溫度為50℃，萃取時間為2.0 h，在此條件下，藜麥甾醇得率可達20.20 mg/g；通過氣相色譜-質譜分析得出，從藜麥油脂中共分離鑒定出29種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸的相對含量為74.59%，亞油酸、亞麻酸和油酸為藜麥油脂的主要脂肪酸。由于藜麥油脂中植物甾醇以及不飽和脂肪酸的存在，使得藜麥油脂可用于功能性食品和化妝品配方。藜麥油脂極具有開發價值。