牙科綜合治療臺水路系統污染微生物調查及其消毒方法

吳曉松，王 玲，吳紅梅，徐宇馨，范晶晶，徐 燕，梁睿貞

(1. 江蘇省疾病預防控制中心，江蘇 南京 210009； 2. 國家衛生健康委員會腸道病原微生物重點實驗室，江蘇 南京 210009； 3. 南京醫科大學附屬口腔醫院護理部，江蘇 南京 210029； 4. 江蘇省口腔疾病重點實驗室，江蘇 南京 210029； 5. 南京醫科大學附屬口腔醫院口腔內科教研室，江蘇 南京 210029)

牙科綜合治療臺使用水來冷卻高速旋轉的牙科手機和沖洗牙齒表面，并在牙科治療期間為患者提供漱口水。互連的牙科綜合治療臺水路系統(dental unit waterlines, DUWLs)組成的復雜網絡向這些器械供水。由于牙科手機在停轉瞬間的“回吸效應”和來自公共供水系統中定植的微生物，DUWLs普遍存在嚴重的微生物污染，是牙科交叉感染的重要危險因素，曾有患者因于牙科就診感染水路中的軍團菌而死亡[1]，DUWLs中的微生物也可能對老年人與免疫缺陷的患者造成嚴重威脅[2]。

DUWLs中微生物種類繁多，存在形式以生物膜和浮游菌兩種為主，研究[3]表明，銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌、大腸埃希菌、阿米巴原蟲、真菌、分枝桿菌等都可以在DUWLs被發現。雖然大部分是條件致病菌，但由于牙科診療操作存在血液、唾液和氣溶膠傳播的風險，因此，如何控制DUWLs中的微生物，成為牙科診療消毒和感染控制的重點。

化學消毒法是目前對DUWLs微生物污染進行消毒與感染控制的主要方法，有報道[4]采用低濃度的化學消毒劑如含氯消毒劑(如次氯酸鈉)、醋酸氯己定等周期性或持續性對DUWLs進行消毒處理，可以有效殺滅DUWLs中的浮游菌，去除生物膜。但在水路中長期使用低濃度的消毒劑對DUWLs會有何影響，是否會導致細菌對消毒劑的敏感性下降，甚至誘導細菌產生抗性而導致消毒失敗尚缺乏相關研究。本研究對定期消毒的DUWLs進行污染微生物種類分析，通過最低抑/殺菌濃度和消毒劑殺滅效果等試驗觀測分離優勢菌對常用水路消毒劑的抗性，為臨床規范和安全使用水路消毒劑提供數據支持，為進一步加強牙科消毒與感染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本與材料 試驗對象為江蘇省某三級甲等口腔專科醫院綜合科使用中牙科綜合治療臺。污染微生物標本來自該院綜合科24臺同品牌同使用年限的牙科綜合治療臺(2011年購置)，該批次牙科綜合治療臺消毒頻次為每2周一次，消毒劑為含氯消毒劑，使用濃度為有效氯500 mg/L。

標準菌株為龜分枝桿菌膿腫亞種 ATCC 93326(軍事醫學科學院，北京)。

1.2 儀器與試劑 飛行質譜鑒定儀(VITEK Mass Spectrometry)購自法國梅里埃公司，恒溫水浴箱購自美國PolyScience公司，恒溫培養箱購自德國Incucell MMM，微生物集菌儀(HTY-601)購自杭州泰林生物技術設備有限公司。

醋酸氯己定(AR)為德國SIGMA公司產品，84消毒劑為江蘇愛特福股份有限公司產品，過氧乙酸消毒劑為南京化學試劑股份有限公司產品，過氧化氫消毒劑為南京化學試劑股份有限公司產品，牛血清白蛋白(BSA)為美國AMRESCO公司產品，營養肉湯培養基和營養瓊脂培養基及相關試劑均為國內市售產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標本采集 于試驗當日開診前半小時采集24臺牙科綜合治療臺高速手機出水口處的水10 mL，連續采集2份標本，采集前先踩手機腳踏控制板，空轉30 s沖洗水管后進行采樣，同時取該牙科綜合治療臺對應的自來水10 mL作為陰性對照組。

1.3.2 細菌計數及鑒定 將出水口每個標本各取1.0 mL、100 μL分別涂布普通營養瓊脂平板和銅綠假單胞菌選擇性平板，35℃培養48 h，進行細菌計數和銅綠假單胞菌選擇性培養，同時對普通營養瓊脂平板上的菌落挑取單個菌落進行四區劃線并純化，剩余標本使用微生物集菌儀進行貼膜培養，并挑取單個菌落進行四區劃線并純化。陰性對照組采用同樣方法進行試驗。挑取平皿四區中的典型菌落，均勻涂在靶板的定位孔內，再加1 μL基質液，以16孔為一個區域，在中心孔涂布標準菌株。輸入靶板號，進入飛行質譜鑒定系統進行鑒定。

1.3.3 病原菌對消毒劑抗力測定 將DUWLs分離的優勢菌產黏液分枝桿菌與標準菌株龜分枝桿菌膿腫亞種分別接種Middlebrook 7H10瓊脂斜面，取37℃培養48 h新鮮培養物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗下菌苔并稀釋配制成菌懸液備用。采用肉湯稀釋法，測定各試驗菌對消毒劑最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)，MIC和MBC試驗均重復3次。

1.3.4 懸液定量殺菌試驗 在20℃試驗條件下將含3%牛血清白蛋白的菌懸液與消毒劑混合作用一定時間，取混合液至中和劑中，中和作用10 min，取0.1 mL涂布營養瓊脂平板，進行活菌計數，同時用TPS稀釋液代替消毒劑進行平行試驗，作為陽性對照。計算殺滅對數值，試驗重復3次。

2 結果

2.1 DUWLs中的細菌含量和微生物檢測結果 24臺DUWLs的48個標本菌落檢出率100.00%，平均菌落數(2.25±1.43)×105CFU/mL，對照組24個自來水標本平均菌落數為(38.21±1.86)CFU/mL，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。經鑒定，24臺DUWLs中共檢出9種污染微生物，其中產黏液分枝桿菌占比(35.72%)最高，未檢出銅綠假單胞菌和軍團菌。見表1。

表1 24臺DUWLs檢出微生物及分布

2.2 優勢菌對常見消毒劑抗力測定結果 經鑒定試驗證明，采用5 g/L硫代硫酸鈉+20 g/L吐溫80+3 g/L卵磷脂肉湯能有效中和醋酸氯己定殘留毒性；5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L吐溫80肉湯能有效中和次氯酸鈉、過氧乙酸、過氧化氫三種消毒劑的殘留毒性。醋酸氯己定、次氯酸鈉、過氧乙酸、過氧化氫對10株優勢菌產黏液分枝桿菌的MIC均分別為1.5、500、5、100 mg/L，4種消毒劑對標準菌株的MIC分別為6、700、25、1 000 mg/L；4種消毒劑對10株優勢菌產黏液分枝桿菌的MBC均分別為3、500、10、200 mg/L，4種消毒劑對標準菌株的MBC分別為600、700、50、1 000 mg/L。4種常用消毒劑對優勢菌的MIC和MBC均低于標準菌株龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC 93326。

2.3 不同消毒劑在不同作用時間對優勢菌的殺滅效果 由于分離的10株產黏液分枝桿菌對4種消毒劑的MIC與MBC一致，選擇1號菌株進一步進行不同消毒劑對其的殺滅效果試驗。結果顯示：0.5%醋酸氯己定在作用30 min時對試驗菌株和標準菌株的平均殺滅對數值均<4.00，未達到消毒要求；0.1%次氯酸鈉作用10 min，對分離優勢菌的殺滅對數值>4.00，作用20 min對標準菌株龜分枝桿菌膿腫亞種的殺滅對數值>4.00，達到消毒要求； 0.1%過氧乙酸作用10 min，對分離優勢菌和標準菌株龜分枝桿菌膿腫亞種的殺滅對數值均>4.00，達到消毒要求；3%過氧化氫作用30 min，對分離優勢菌和標準菌株龜分枝桿菌膿腫亞種的殺滅對數值均>4.00，達到消毒要求。見表2。

表2 4種常用消毒劑對試驗菌株及標準菌株不同作用時間的殺滅對數值

3 討論

本研究發現，該醫院DUWLs被大量的微生物污染，數量級達到105，細菌來自水路中浮游菌和生物膜，與以往的研究[5]相近。通過質譜分析儀進一步分析菌群的構成，共分離9種微生物，其中產黏液分枝桿菌占比最高，達35.72%，其次為真菌，占21.43%，另有少量的艱難梭菌、螯肢分枝桿菌等，但未檢出銅綠假單胞菌和軍團菌。此結果與Barbeau等[6]報道DUWLs中銅綠假單胞菌的檢出率達24%存在差異，也使本研究利用銅綠假單胞菌篩選培養基對其主動收集的研究設計未能得以體現，但與鮑容等[7]對醫院供水系統分枝桿菌污染的調查結果相近。分析其原因為水路系統中細菌繁多，生態復雜，不同醫院不同科室的DUWLs中可能存有不同的細菌生態；其次更可能的原因是飲用水系統經氯化處理后系統內的菌落發生變化，非致病性分枝桿菌和鞘氨醇屬為菌落中的優勢菌[8]，不同水源、不同條件下供水系統生物膜內菌落的研究中，均檢測到分枝桿菌，某些情況下分枝桿菌為其主要菌落[9-11]。而該口腔醫院一直使用含氯消毒劑對DUWLs進行定期消毒，由此可見，對DUWLs的消毒處置特別是使用含氯消毒劑可能是本研究中產黏液分枝桿菌成為優勢菌的原因之一。

產黏液分枝桿菌屬于非結核分枝桿菌(Nontuberculosis mycobacteria， NTM)中的快速生長分枝桿菌，可通過呼吸道、胃腸道、皮膚黏膜等途徑侵入人體，作為一種條件致病菌，通常情況下可在人體中保持平衡，多在機體抵抗力下降時發病，可導致淋巴結炎、慢性肺部疾病、創傷后皮膚感染和敗血癥等，與醫院感染密切相關[12]。近年來NTM的檢出率及其感染發病率不斷增高，有研究[13]報道南京地區NTM檢出率為15.5%，感染發病率為56.5%。墨西哥一所創傷醫院的飲用水標本中NTM檢出率為52%，其中產黏液分枝桿菌占81%[14]，另有研究[15]報道產黏液分枝桿菌通過醫院供水系統，在患者淋浴時污染中央靜脈導管，導致患者菌血癥的暴發。本研究中的口腔診療多為有創操作，常需直接接觸患者的血液、唾液和口腔黏膜等，同時高速手機在運轉時又需要不斷的供水冷卻，DUWLs的污染可導致交叉感染，因此，對DUWLs中分枝桿菌的高檢出率應高度重視。

細菌對消毒劑的抗性是指出現對常用濃度的消毒劑不再敏感的菌株，普遍認為廣泛或不合理使用消毒劑可產生篩選壓力[16]，若長期使用亞致死濃度的消毒劑，則易導致細菌對該濃度的消毒劑產生適應效應，最終演變為對消毒劑的抵抗[17]。臨床流行的分枝桿菌對2%醋酸氯己定具有高度抗性[18]，本研究中雖然在MIC、MBC中未觀察到產黏液分枝桿菌對醋酸氯己定的抗性超過標準菌株，但在懸液定量殺菌試驗中，30 min內常用濃度的醋酸氯己定并不能有效殺滅產黏液分枝桿菌，提示無論是在DUWLs中使用醋酸氯己定進行消毒還是通過含漱液(含醋酸氯己定)預防控制患者口腔感染，都存在感染風險。另外通過對口腔診療中現行DUWLs消毒與感染控制措施的初步研究發現，水路中分離的產黏液分枝桿菌對高效消毒劑(含氯消毒劑、過氧化氫、過氧乙酸)的抗力也有部分發生變化，其對次氯酸鈉的MIC及MBC值均較高，接近標準菌株的抗力水平，提示使用的化學消毒法，已對本研究所選醫院DUWLs的污染微生物菌群產生影響，對含氯消毒劑抗力更強的NTM已取代銅綠假單胞菌與軍團菌成為優勢菌群，因此在對本研究所選醫院DUWLs進行化學消毒時應特別注意消毒劑種類的選擇，濃度、頻率及操作的規范化。

本研究僅對一所三級口腔專科醫院進行研究，數據覆蓋面較小，在DUWLs中NTM是否因為消毒方式的選擇而廣泛取代銅綠假單胞菌等傳統優勢菌群還需要進一步研究。