葛根素對順鉑誘導小鼠卵巢早衰的作用研究*

張洪英，梁瑞，曹長順，柯宗文，杜益茗，楊艷鳳，梁艷明

（1.錦州醫科大學，遼寧 錦州121000；2.錦州市中醫院，遼寧 錦州121000；3.錦州市中心醫院，遼寧 錦州121000）

卵巢早衰（premature overian failure,POF）是<40 歲女性因卵泡耗盡或停止發育所致卵巢功能減退到一定階段所呈現的疾病狀態[1]。導致POF的因素很多，如化療或放療、醫源性因素、遺傳變異、自身免疫性卵巢萎縮、各種環境因素（病毒、毒素和吸煙）等[2]。順鉑是目前應用最為廣泛的化療藥物之一，能損傷卵巢功能結構[3-4]，嚴重影響女性的身心健康。激素替代療法已成為治療POF 的首選方案，但也存在很大的致病風險。近年來由于化療藥物的廣泛應用，使POF 的發病率逐年上升。對患有惡性腫瘤的育齡女性患者來說，化療損傷性腺功能，是導致POF 的一個重要原因。隨著惡性腫瘤育齡女性患者遠期生存率的升高，為滿足這些患者的生育需求及提高其生活質量，臨床需要尋找新的治療POF 的方法。葛根素是從葛根中提取的主要成分[5]，具有與植物雌激素大豆異黃酮相似的化學結構[6]，而且有抗凋亡的作用[7]。葛根素在治療POF的研究報道甚少。本研究應用順鉑誘導復制小鼠卵巢早衰模型，探討葛根素對順鉑誘導小鼠卵巢早衰的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取30 只6 周齡雌性C57BL/6J小鼠，體重19～24 g，購自北京圍通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，1100111911080486。所有小鼠在SPF 級動物實驗中心飼養，自由進食飲水，室溫20～23℃、濕度50%～65%，12 h/12 h 晝夜交替光照。小鼠隨機分為對照組、模型組及實驗組，每組10 只。所有實驗操作均符合錦州醫科大學動物倫理委員會要求。

1.1.2 藥物和試劑順鉑粉劑（購自美國Sigma 公司），葛根素注射液（購自成都天臺山制藥有限公司），Cleaved caspase-3 多克隆抗體、Bcl-2 多克隆抗體、Bax 多克隆抗體（購自美國Abcam 公司），山羊血清、過氧化氫、PBS、檸檬酸、檸檬酸鈉、熒光二抗、PI、抗熒光衰減封片劑（購自北京中山生物技術有限公司），小鼠E2、FSH、AMH 的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（購自江蘇酶標生物公司），DAB 顯色試劑盒（購自上海碧云天生物公司）。

1.1.3 實驗儀器BT224S 電子秤、PB-21PH 儀（德國賽多利斯有限公司），LEICA-TP1020 全自動脫水機、LEICA-EG-115OH 包埋機、低溫超速離心機（德國徠卡公司），SZX-7 體視顯微鏡、BX41 正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標儀（英國Biochrom Anthos 公司），光學顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的復制小鼠給藥途徑均為腹腔注射。模型組先給予9 d 生理鹽水（4.0 ml/kg），再給予5 d 順鉑（4.5 mg/kg）及生理鹽水（4.0 ml/kg）。實驗組先給予9 d 葛根素（200.0 mg/kg），再給予5 d葛根素（200.0 mg/kg）及順鉑（4.5 mg/kg）。對照組給予同體積生理鹽水14 d。實驗第9 天時，稱重小鼠并記錄，觀察小鼠的活動、飲食及皮毛光澤度。實驗第15 天脫頸處死所有小鼠，迅速心尖取血，3 000 r/min 離心15 min，取上清液待測。將小鼠卵巢標本放入Davision's 溶液中固定24 h，待石蠟包埋切片。

1.2.2 小鼠陰道涂片每天觀察3 組小鼠的飲食、活動及皮毛變化等情況，每天8:00 將10 μl 生理鹽水注入小鼠陰道內，反復沖洗3 次后用消毒棉簽插入小鼠陰道約0.4 cm，輕柔轉動取出分泌物后置于載玻片上，亞甲藍染色，觀察結果。

1.2.3 ELISA 法檢測E2、FSH 及AMH 水平ELISA試劑盒室溫平衡30 min。血清標本置冰上溶解30 min。標準品稀釋，分別設置空白、標準、待檢樣品3 個孔，加樣，37℃溫育30 min，洗滌后加入酶標試劑50 μl，溫育，依次加顯色液A、B，37℃顯色10 min，滴加終止液，加入終止液的15 min內在酶標儀450 nm 處檢測各孔的光密度（OD）值，根據標準品的OD 值及濃度繪制標準曲線，計算出各樣品的濃度。

1.2.4 小鼠卵巢組織石蠟切片制備及HE 染色室溫下，固定好的卵巢組織放入組織盒內水洗，置于脫水機中，梯度酒精脫水及二甲苯透明，浸蠟，置入包埋框中，放平其底部，倒入液體石蠟，制成卵巢石蠟組織塊。石蠟組織切片，厚度為5 μm。切片在53℃溫水中展開，平整貼附在載玻片上，60℃烤片機烤片3 h，脫蠟水化，蘇木精染色，分化反藍處理，伊紅染色，PBS 水洗，脫水透明封片，光學顯微鏡觀察結果。

1.2.5 免疫熒光染色卵巢石蠟組織切片60℃烤片機烤片45 min，常規二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，PBST 水洗3 次，每次5 min，抗原修復（98℃檸檬酸鈉抗原修復液處理10 min），自然冷卻20 min，加速冷卻至室溫，10%山羊血清室溫封閉60 min，滴加一抗（1∶200）置于濕盒中，4℃冰箱孵育過夜，取出濕盒恢復至室溫，滴加二抗室溫避光孵育30 min，PBST水洗3 次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅劑，蓋好蓋玻片，應用熒光顯微鏡激發光460～550 nm 激發出綠色熒光圖，激發光530～550 nm 激發出紅色熒光圖，取圖并分析結果。

1.2.6 western blotting法檢測Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量將細胞裂解液RIPA 加入各組卵巢組織，置于冰面裂解30 min，卵巢組織經研磨后吸出1.5 ml 置于EP 管，5 000 r/min 離心5 min，吸出1.5 ml 上清液，用BCA 法測定卵巢組織中蛋白濃度，根據SDS-PAGE 試劑盒制膠，電泳，將膠片上的蛋白濕轉轉印至PVDF 膜，將轉印膜置于1% BSA 中，室溫封閉2 h，加一抗稀釋液Cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax（濃度為1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST 洗滌，加入HRP 標記的山羊抗兔的二抗，室溫中孵育1 h，采用底物化學發光ECL 法顯影，β-actin 為內參。

1.3 統計學方法

數據分析SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重量復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況

正常組小鼠的毛光亮、動作靈敏、活躍、攝食頻繁，對外界刺激的反應性良好。模型組小鼠毛色澤暗淡、活動少、攝食少、對外界刺激的反應性差。實驗組小鼠毛的光澤度、活動、攝食對外界刺激的反應性及靈活性相對模型組有改善。

2.1.1 小鼠體重變化實驗第10 天、第11 天、第12 天、第13 天、第14 天3 組小鼠體重比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點小鼠的體重有差異（F=397.937，P=0.000）；②3 組小鼠的體重有差異（F=16.386，P=0.000）；③3 組小鼠體重的變化趨勢有差異（F=546.834，P=0.000），模型組與對照組相比體重呈現下降趨勢，實驗組與模型組相比小鼠體重下降更加平緩。見表1和圖1。

圖1 3組小鼠體重隨時間變化趨勢

表1 3組小鼠體重比較（n=10，g，±s）

表1 3組小鼠體重比較（n=10，g，±s）

組別對照組模型組實驗組第10天21.16±0.84 22.24±1.48 23.18±0.70第11天21.22±0.85 20.92±1.33 22.66±0.67第12天21.24±0.79 19.18±1.38 21.80±0.69第13天21.32±0.73 18.00±1.17 21.20±0.53第14天21.52±0.68 16.56±1.06 21.32±0.63第15天21.54±0.72 15.66±1.02 20.68±0.59

2.1.2 動情周期觀察正常小鼠動情周期（4～6 d）分為4 個階段，各個時期陰道脫落細胞的變化為：①動情前期見大量的有核上皮細胞和少量的角化細胞，無白細胞；②動情期可見滿視野的無核角化上皮細胞和少量有核上皮細胞；③動情后期有大量的白細胞出現，見少量的有核上皮細胞；④動情間期則出現大量的白細胞（見圖2）。實驗過程中通過陰道分泌物涂片發現，對照組有正常的動情周期，動情周期較為規則。3 組的動情間期構成比（動情間期與總動情周期的比值）分別為對照組（36.33±0.09）%，模型組（76.62±0.08）%，實驗組（58.33±0.08）%，3 組比較，差異有統計學意義（F=29.955，P=0.000）；進一步兩兩比較，模型組小鼠動情間期構成比高于對照組（P<0.05）；實驗組小鼠動情間期構成比低于模型組（P<0.05）（見圖3）。

圖2 正常小鼠動情周期4個時期的陰道圖（亞甲藍染色×400）

圖3 3組小鼠動情間期構成比比較（n=10，±s）

2.2 3組小鼠血清E2、AMH、FSH水平比較

3 組小鼠血清E2、AMH 和FSH 水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與對照組比較，模型組小鼠血清E2 和AMH 水平降低，FSH 水平升高（P<0.05）；與模型組比較，實驗組小鼠血清E2 和AMH水平升高，FSH水平降低（P<0.05）。見表2。

表2 3組小鼠血清激素水平比較（n=10，±s）

表2 3組小鼠血清激素水平比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對照組模型組實驗組F 值P 值FSH/（Pg/ml）2.59±0.12 3.60±0.04①3.12±0.04②180.365 0.000 E2/（pmol/L）117.79±2.81 74.55±2.81①98.00±6.24②100.131 0.000 AMH/（mlU/ml）40.01±0.69 23.70±2.09①65.38±3.15②358.040 0.000

2.3 3組小鼠卵巢組織形態

對照組可見不同發育階段的卵泡，成熟卵泡處于卵巢的邊緣，顆粒細胞規則排列，有時呈現放射狀；模型組的卵巢間質出現纖維化改變，卵泡閉鎖，卵泡顆粒細胞減少、排列紊亂，甚至消失、轉化為結締組織細胞；實驗組可見閉鎖卵泡很少，成熟卵泡處于卵巢邊緣，顆粒細胞有序排列并且數目多。見圖4。

圖4 3組小鼠卵巢組織形態（HE染色）

2.4 3 組小鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達

免疫熒光染色結果顯示Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 在3 組小鼠卵巢組織中均有表達，且以顆粒細胞為主。見圖5。

圖5 3組小鼠卵巢Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表達（免疫熒光染色×200）

2.5 3 組小鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量比較

3 組小鼠卵巢組織Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，模型組與對照組比較，卵巢組織細胞Bcl-2 蛋白相對表達量減少，Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對表達量增加（P<0.05）；實驗組與模型組比較，卵巢組織Bcl-2 蛋白相對表達量增加，Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對表達量減少（P<0.05）。見圖6和表3。

表3 3組小鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

表3 3組小鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對照組模型組實驗組F 值P 值Cleaved-caspase-3 96.07±4.18 139.99±2.77①113.71±5.32②82.301 0.000 B cl-2 96.52±1.33 55.95±1.75①89.18±2.11②452.710 0.000 Bax 46.42±2.13 100.21±1.22①63.94±2.54②542.075 0.000

圖6 3組小鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達

3 討論

POF 是早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）的最后階段。近年來化療藥物的廣泛應用是POF發病率逐年提升的主要因素[8]。卵巢由含有大量卵泡的皮質和髓質構成，成熟卵泡位于卵巢邊緣。卵泡是由卵母細胞及其周圍排列規則、具有分泌雌激素功能的顆粒細胞等結構組成。POF 的特點是垂體分泌的FSH 水平升高，雌激素不足[9-11]。POF 主要臨床表現有月經量減少、生育率低，潮熱多汗、神經質、性欲減退，此外還有心腦血管疾病及骨質疏松、泌尿生殖道萎縮、抑郁癥等風險，嚴重者有自殺傾向[12]。POF 的治療方法很多，如激素替代治療、免疫療法、低溫保卵技術及卵巢移植、心理治療、干細胞治療、基因治療、中藥及天然植物提取物治療。激素替代治療可以改善POF 女性的潮熱及陰道和泌尿系統癥狀，有助于保持骨骼健康，減少骨質疏松的機會，還可預防心臟病[13]，但是存在很大的患病風險如乳腺癌、子宮內膜癌及靜脈血栓栓塞等[14-16]。骨髓間充質干細胞（BMSC）對恢復順鉑引起POF 中的受損卵巢起重要作用[17]，還可以在化療引起的POF 小鼠模型中恢復卵巢激素的產生并重新激活卵泡形成[18]。POF 的治療方法很多，但尚無長期應用于臨床的方法。

有研究通過體內及體外實驗證實了葛根素可以競爭E2 受體，抑制雌激素發生作用，從而在子宮內膜異位癥中起調控作用[19]。本研究結果發現，模型組小鼠毛色澤暗淡、活動少、攝食少、對外界刺激的反應性差，體重下降明顯，動情間期延長。雖然實驗組的E2 水平相對于模型組增加，但并不能證明葛根素有改善卵巢功能的作用。隨之檢測小鼠血清FSH、AMH 水平，結果顯示，相較于模型組，實驗組小鼠血清FSH 水平降低，AMH 水平升高，這表示模型復制成功，同時表明，葛根素可以改善順鉑損傷的卵巢功能。小鼠卵巢組織切片HE 染色結果顯示，相對于模型組，實驗組可見閉鎖卵泡少，成熟卵泡位于卵巢周圍，顆粒細胞排列有序且數目多，這通過體內實驗證明葛根素對順鉑損傷的小鼠卵巢結構及功能具有保護作用。

凋亡是通過清除機體內病變細胞來維持正常組織生長的一種重要的程序性細胞死亡[20]。凋亡途徑的失調是導致人類疾病的重要因素。Bax 是Bcl-2 家族中重要組成部分，它包含BH1、BH2、BH33 個結構域，并能誘導線粒體外膜釋放細胞色素?，導致Caspase 家族的激活引起級聯反應[21-22]。Bcl-2 家族抗凋亡蛋白包括的Bcl-2 和Bcl-X，可以通過阻止細胞色素C 的釋放，從而抑制凋亡發生[23-24]。YU 等[7]通過體外實驗證明葛根素可以通過調控Bax 和Bcl-2 的活性來抑制細胞色素C 的釋放和Cleaved caspase-3 的降解，來抑制hFOB1.19 細胞的凋亡。YUAN 等[24]通過實驗證實葛根素通過抑制NF-κB 的級聯反應，從而下調Bax 及上調Bcl-2，對LPS 誘導的H9c2 心肌細胞凋亡具有保護作用。有研究指出在體外實驗中葛根素對于卵巢顆粒細胞具有保護作用[25-26]。本研究免疫熒光染色檢測結果顯示Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 在3 組小鼠卵巢組織中均有表達，且以顆粒細胞為主。Western blotting 法檢測Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對表達量發現，模型組與對照組相比，卵巢組織細胞中Bax、Cleaved caspase-3蛋白相對表達量增加，Bcl-2 蛋白相對表達量減少；實驗組與模型組比較，卵巢組織細胞中Bax、Cleaved caspase-3 蛋白相對表達量減少，Bcl-2 蛋白相對表達量增加。因為卵巢由淺層的皮質和深層髓質構成，皮質占大多數，并且被大量的卵泡所占據，卵泡主要是由卵母細胞及其周圍的顆粒細胞構成，結果表明凋亡蛋白大多數表達在顆粒細胞中。CHENG 等[19]通過免疫組織化學及免疫蛋白印記等技術發現順鉑誘導的小鼠POF 模型中，顆粒細胞異常凋亡，小鼠卵巢組織細胞Bax 上調，Bcl-2 下調。本研究結果與其他研究結果一致。

綜上所述，順鉑可導致小鼠卵巢組織細胞凋亡，以顆粒細胞為主，引起卵巢功能減退。葛根素能抑制卵巢組織細胞凋亡，恢復卵巢功能，改善POF 小鼠的一般活動及狀態。葛根素對順鉑損傷的小鼠卵巢結構及功能均有保護作用，為臨床治療化療引起的POF 提供新的治療思路，同時為完善葛根素的臨床應用提供參考。