侵染葡萄的葡萄病毒屬病毒研究進展*

劉曉萌，李小燕，張 斌，張 磊，孫平平，李正男

（1 內蒙古農業大學園藝與植物保護學院，呼和浩特010018）（2 內蒙古師范大學生命科學與技術學院）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界上最古老的果樹樹種之一，目前，葡萄在世界范圍內廣泛分布。除鮮食外，葡萄還可用來釀酒和加工成葡萄干。近年來，由葡萄病毒屬病毒引起的樹體生長衰退、果實品質下降等問題在葡萄產區普遍發生，其中發展最普遍、危害最嚴重的就是葡萄皺木復合癥[1]。對這類病毒的防治已成為葡萄生產上急需解決的問題。

葡萄病毒屬屬于蕪菁黃花葉病毒目乙型線形病毒科。截至目前，侵染葡萄的葡萄病毒屬病毒共發現12種，分別是葡萄病毒A（GVA）、葡萄病毒B（GVB）、葡萄病毒D（GVD）、葡萄病毒E（GVE）、葡萄病毒F（GVF）、葡萄病毒G（GVG）、葡萄病毒H（GVH）、葡萄病毒I（GVI）、葡萄病毒J（GVJ）、葡萄病毒K（GVK）、葡萄病毒L（GVL）和葡萄病毒M（GVM）。之前暫定為葡萄病毒屬的葡萄病毒C 現被發現不屬于葡萄病毒屬[2]。

葡萄病毒屬病毒粒子為彎曲的桿狀或線條狀，長約800 nm，直徑12 nm，螺旋對稱結構。基因組為單分體，線形正義單鏈RNA 分子，長7.4～7.6 kb，5′端為帽子結構，3′端有poly（A）尾巴。基因組編碼5個開放閱讀框（ORF）。葡萄病毒屬病毒可通過機械接種傳播，其中嫁接和繁殖材料是病毒傳播最普遍的途徑，個別葡萄病毒屬病毒也可由粉蚧傳播，詳見表1。綜述了近20 年來侵染葡萄的葡萄病毒屬病毒的生物學特性、分子進化現狀、致病機制等研究進展情況，并且從NCBI 的GenBank 數據庫下載了12種葡萄病毒的基因組序列，共53 條（表1），使用MEGA 6.0 軟件，采用NJ 法，自展值設置為1 000，構建了系統發育進化樹，基于全長基因組序列對12種葡萄病毒屬病毒進行了系統進化分析，加深了對葡萄病毒屬病毒種群結構與進化策略的理解，以期為設計合理的葡萄病毒病害防治策略提供依據[3]。

表1 侵染葡萄的葡萄病毒屬病毒詳細信息

1 侵染葡萄的葡萄病毒屬病毒

1.1 葡萄病毒A（GVA）

GVA 最初于1980 年在意大利被發現[4-5]，目前該病毒在世界各地葡萄種植區均有發生，是最為常見的葡萄病毒之一，已在中國、意大利、南非、約旦、捷克共和國等多個國家和地區發生危害，但不同地理區域的發病率差異很大。Boscia 等[6]研究表明，阿爾巴尼亞和馬耳他的GVA 感染率最高，而馬格里布最低，意大利葡萄品種平均侵染率約為30%。葡萄皺木復合癥是在葡萄上嚴重發生的一類病害，主要引起莖溝、莖痘以及砧木或幼芽木質部扭曲，嚴重的造成藤早期死亡。根據嫁接到指示植物上的癥狀，可以將葡萄皺木復合癥分為4 類，分別是LN33 莖溝病（LNSG）、沙地葡萄莖痘病（RSP）、克勃莖溝病（KSG）及栓皮病（CB），研究證明，GVA 是克勃莖溝病病原[2,7]。

GVA 自然寄主范圍狹窄，木本寄主目前只有葡萄，草本寄主主要是一些煙草，如本氏煙、克利夫蘭煙、西方煙、麥格隆熄豐煙及凱維科拉煙。GVA可以通過幾種粉蚧傳播，可以傳播GVA 的粉蚧主要有擬長尾粉蚧（Pseudococcus longispinus）、擬葡萄粉蚧（Pseudococcus affinis）、橘臀紋粉蚧（Planococcus citri）、榕臀紋粉蚧（planococcus ficus）和舊北星粉蚧（Heliococcus bohemicus），還有新棉蚧（Neopulvinaria innumertabitis）及水木堅蚧（Parthenolecanium corni）的幼蟲[2]。同時GVA 是傳播葡萄卷葉相關病毒1（GLRaV-1）和葡萄卷葉相關病毒3（GLRaV-3）的輔助因子。GVA 基因組正義單鏈RNA 分子全基因組序列長度為7 349 nt[8-10]，編碼5個ORF，其中ORF1 編碼RNA 聚合酶（RdRp），ORF2 編碼1個19 kDa 但功能未知的蛋白產物，ORF3 編碼的是運動蛋白（MP），ORF4編碼了外殼蛋白（CP），ORF5 編碼1個10 kDa 核酸結合蛋白（NABP）[11-12]。NCBI 的GenBank 數據庫可以檢索到15 條GVA 的全長基因組序列，通過構建系統發育進化樹可以將15個分離物分為2 大組。第1 組包括13 條，分別來自南非、意大利、以色列、法國和克羅地亞，另外1 組包括2 條，分別來自南非和加拿大（圖1）。

圖1 12種侵染葡萄的葡萄病毒屬病毒全長基因組序列系統發育樹

GVA 具有基因組的不穩定性，導致了更高的突變率，也就是基因的異質性。Zhou 等[13]研究發現并確定了GVA 病毒的ORF5 為該病毒的致病因子，其致病性是ORF5 編碼的P10 蛋白直接作用的結果，同時P10 還是一個弱的基因沉默抑制子。Haviv 等[14]研究表明，P10 的第8個氨基酸殘基，分別是丙氨酸（Ala）和蘇氨酸（Thr），會影響P10 的基因沉默抑制能力。

1.2 葡萄病毒B（GVB）

GVB 與葡萄皺木復合癥同樣有密切聯系，在1997 年的第十二屆國際葡萄病毒類病毒研究大會上將GVB 定為栓皮病的病原[15]。該病毒的草本寄主分別是本氏煙、西方煙和凱維科拉煙。GVB 的傳播介體是粉蚧，分別是擬葡萄粉蚧和榕臀紋粉蚧。基因組為單分子線性RNA，長約7.6 kb。Hu 等[16]、李正男等[17]獲得的GVB 中國分離物基因組分別長7 599、7 600 nt，Goszczynski[18]獲得的GVB 全基因組序列總長為7 599～7 601 nt。GVB 基因組包括5個開放閱讀框，ORF1 編碼RdRp；ORF2 編碼1個功能未知蛋白；ORF3 編碼MP；ORF4 編碼的是CP；ORF5 編碼NABP，GVB 與GVA 的ORF5 產物功能類似，也有RNA 沉默抑制活性[18]。從NCBI 的GenBank 數據庫可以檢索到9 條GVB 的全長基因組序列，分為2 大組，第1 組共有2 條，分別來自中國、巴西，第2 組來自南非、加拿大、意大利和克羅地亞（圖1）。

研究表明[16,19]，GVB 基因組同樣具有廣泛異質性。除ORF4 以外的所有開放閱讀框的氨基酸序列都含有高度分化的區域，并且還發現ORF4 與ORF5之間還存在1個特別的基因區間，這可能是ORF5的啟動子。前人研究[20-21]表明，GVB 與GVA 被分為纖毛病毒屬（Trichovirus），最終發現與纖毛病毒屬的蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）和馬鈴薯病毒T（PVT）在分子、生物學上存在差異，所以將GVA、GVB 重新歸類為葡萄病毒屬。

1.3 葡萄病毒D（GVD）

GVD 在土耳其首次報道[22]。目前在突尼斯共和國、巴西等國家也有該病毒發生的報道。感染了GVD 的葡萄表現為木栓狀皺紋癥狀，但該病毒在皺木復合癥中的具體作用仍不清楚，對于GVD 相關研究至今還較少[23-24]。該病毒基因組全長為7 479 nt，包括5個ORF，ORF1 編碼RdRp，ORF2 編碼假定蛋白，ORF3 編碼MP，這3個ORF 序列在NCBI中找到，目前在其他文獻中沒有ORF1、ORF2、ORF3的基因序列的信息；ORF4 編碼CP；ORF5 編碼NABP。Fajardo 等[25]假設GVD 的ORF5 也有基因沉默抑制功能，但在后續并沒有驗證這一假設。根據NCBI GenBank 數據庫報道，目前只有1 條GVD 的全基因組序列，來自克羅地亞（圖1）。

1.4 葡萄病毒E（GVE）

GVE 在日本首次被發現[19,26]，在阿根廷和中國也有報道[27-28]，南非首次報道了GVE 的完整基因組序列[19]，發現GVE 的基因組結構與GVA 相似[20]。在華盛頓‘赤霞珠’葡萄樣本中獲得的GVE，全基因組序列長度為7 568 nt[20,29]，與其他侵染葡萄的葡萄病毒屬成員相同，GVE 基因組共編碼5個ORF。其中，ORF1 編碼與病毒復制相關的蛋白，包括甲基轉移酶（MTR）、解旋酶（HEL）和RdRp。在GVE 基因組序列中，解旋酶區域均包含1個2OG-Fe（Ⅱ）氧合酶結構域（AlKB），有研究表明，AlKB參與甲基化修復，對抗寄主的防御機制。根據NCBI GenBank 數據庫報道，有5 條GVE 全基因組序列，分為2 大組，其中第1 組有2 條，分別來自南非和美國，第2 組來自日本、克羅地亞和中國（圖1）。目前，GVE 是唯一被發現AlKB 位于解旋酶區域內部的植物病毒[24,30]。

1.5 葡萄病毒F（GVF）

伊朗第1 次報道了GVF[31]，GVF 的全基因組序列長為7 539 nt，ORF1 編碼RdRp，ORF2、ORF3、ORF4、ORF5分別編碼假定蛋白、MP、CP和NABP[32]，Fan 等[28]發現GVF 也與皺木復合癥相關。目前關于GVF 的研究較少。根據NCBI GenBank 數據庫的報道，共有3 條全基因組序列，第1 組的1 條來自南非，第2 組的2 條均來自美國（圖1）。

1.6 葡萄病毒G（GVG）

GVG 在新西蘭被發現，該病毒的基因組全長為7 496 nt，包含5個ORF，ORF1 編碼的多聚蛋白包括4個識別域，分別為MTR、HEL、AlKB 及RdRp；ORF2 編碼1個未知功能的蛋白；ORF3 編碼病毒運動蛋白質結構域；ORF4 編碼1個與ORF3 稍重疊的蛋白，且該蛋白具有識別毛狀外殼蛋白結構域的功能；ORF5 是其中最短的1個ORF，編碼病毒核酸結構域[33]。從 NCBI 的 GenBank 數據庫可以檢索到6 條GVG 的全長基因組序列，共分為2 大組，第1 組包括2 條，均來自克羅地亞，第2 組全部來自新西蘭（圖1）。通過GenBank 數據庫基因庫比對，該病毒與GVE、太匱龍舌蘭葉病毒（ATLV）親緣關系最近。

1.7 葡萄病毒H（GVH）

GVH 是在葡萄牙的1個無病癥葡萄上發現的，全基因組序列長度為7 446 nt，編碼5個ORF，基因組包含5′和3′非編碼區，分別長97、85 nt，包含1個編碼約20 kDa 大小功能未知的ORF2，而且與GenBank 數據庫中任何蛋白都不相關；ORF1 編碼195.1 kDa 的病毒復制酶，ORF1 與其相對應的秘魯胡蘿卜B 病毒（AVB）序列相似性是最高的，其次是GVB；ORF4 編碼CP，與ORF4 親緣關系最近的是GVD，其次是GVK；ORF3 編碼1個29.2 kDa 的MP，經過序列比對，與GVA3 的CP 最相近；ORF5編碼1個12.2 kDa 大小的NABP，具有基因沉默抑制能力，與薄荷病毒2（MV-2）的NABP 一致性最高[34]。根據NCBI 中GenBank 數據庫報道，共有3條GVH 的全基因組序列，分為2 大組，其中1 條來自加拿大，2 條都是來自葡萄牙（圖1）。

1.8 葡萄病毒I（GVI）

GVI 是在新西蘭的‘霞多麗’葡萄球菌樣本中鑒定出的。GVI 基因組全長為7 507 nt，與該病毒親緣關系最近的是GVE，2種病毒在ORF1 和ORF4的比較中，氨基酸和核苷酸序列的一致性最高。GVI包括5個ORF，ORF1 編碼多聚蛋白，包括MTR、HEL、AlKB 及RdRp 4個結構域；ORF2 編碼1個與ORF1 稍重疊的假定蛋白；ORF3 編碼1個包含病毒運動蛋白結構域的蛋白質；ORF4 與ORF3 重疊，并且編碼1個包含毛狀結構域的蛋白，該蛋白與ATLV 外殼蛋白的氨基酸序列一致性最高，其次是與GVE，最后是GVG；ORF5 編碼1個NABP，而該蛋白與GVE 有最近的親緣關系。由NCBI 的GenBank 數據庫可知，有3 條GVI 全基因組序列,分為2 組，第1 組有2 條，來自新西蘭，第2 組來自希臘（圖1）。

研究表明，該病毒的復制酶基因結構顯示了AlKB 的位置改變，雖然氧合酶蛋白廣泛存在于細胞有機體內，但只在感染多年生寄主的病毒中發現，它們的作用可能是防止甲基化損傷[30]。

1.9 葡萄病毒J（GVJ）

GVJ 是在土庫曼斯坦的一個白葡萄品種‘Kizil Sapak’上檢測出來的。該病毒全基因組長度為7 390 nt，同樣包含5個ORF 以及5′和3′非編碼區，ORF1編碼大小為194.6 kDa 的蛋白質，與GVA 的ORF1氨基酸序列有最高一致性，其中包括以下結構域：MTR、AlKB、HEL 以及RdRp；ORF2 編碼1個功能未知的蛋白結構；ORF3 編碼MP，并與GVA 的CP 氨基酸序列一致性表現出最高；ORF4 編碼大小為21.7 kDa 的CP，與GVD 的CP 顯示出的氨基酸序列一致性是最高的；最后，ORF5 編碼的NABP，與病毒中存在RNA 結合蛋白相似[35]。根據系統進化樹顯示，該病毒與GVD 具有最近親緣關系，其次是GVK。根據NCBI 的GenBank 數據庫報道，共有2 條GVJ 全基因組序列，均來自土庫曼斯坦（圖1）。

1.10 葡萄病毒K（GVK）

GVK 是一種新發現的正義單鏈RNA 病毒，全基因組序列長為7 476 nt，包含5′和3′非翻譯區，分別長80、77 nt。該病毒同樣包括5個ORF，ORF1編碼RdRp；ORF2 編碼1個功能未知的蛋白質；ORF3 編碼的是MP；ORF4 編碼CP；ORF5 編碼NABP。通過BLASTp（protein BLAST）搜索發現，GVK 的ORF1 與GVA 同源，ORF3 和ORF4 與GVA和GVD 的序列相似，ORF5 的序列與GVD 相似[36]。有研究表明，GVK 是GVD 的變種[33]。根據NCBI的GenBank 數據庫報道，目前只有1 條來自克羅地亞的GVK 全基因組序列（圖1）。

1.11 葡萄病毒L（GVL）

GVL 的全基因組序列長為7 607 nt，同樣包括5個典型的ORF。通過對不同國家[37]不同品種的葡萄樣品檢測結果表明，所鑒定的病毒分布較為廣泛且種類繁多。但GVL 的生物學特性仍然不清楚。ORF1編碼RdRp，與GVE 的復制酶蛋白序列相似性最高；ORF2 與ORF1 重疊并編碼1個功能未知的富含亮氨酸的蛋白質，并且是檢測出的病毒中差異最大的蛋白質，所以該作者猜測這種重疊可能是終止-啟動的信號，該病毒的ORF2 與GVE 的ORF2 編碼的假設蛋白有44%的相似性；ORF3 編碼MP，具有病毒運動蛋白結構域；ORF4 與ORF3 部分重疊，編碼CP，是具有一個毛狀病毒外殼蛋白的結構域，該病毒的CP 與GVE 的CP 具有78.4%的相似性；ORF5編碼NABP[38]。目前NCBI 的GenBank 數據庫報道，有4 條GVL 全基因組序列，共分為2 組，第1 組有2 條，分別來自中國和克羅地亞，第2 組有2 條都是來自美國（圖1）。

1.12 葡萄病毒M（GVM）

GVM 是在美國德克薩斯州的雜交品種‘白布娃’中發現的，是一種新型病毒，該病毒全基因組序列長為7 387 nt，包括5個ORF，ORF1 編碼RdRp，與GVH 的復制相關蛋白有最高的核苷酸序列一致性和氨基酸序列同源性；ORF2 編碼功能未知的假定蛋白，與GVH 的ORF2 分別有55%核苷酸序列一致性、65.6%的氨基酸序列同源性；ORF3 編碼MP，與GVH 的MP 分別有70.2%核苷酸序列一致性和69.7%的氨基酸序列一致性；ORF4 編碼CP，與GVH 的CP 具有最高核苷酸序列一致性和氨基酸序列一致性；ORF5 編碼的是NABP，與GVH 的NABP 也具有最高核苷酸序列一致性和氨基酸序列一致性[39]。綜上所述得出與其最近的親緣關系是GVH。根據NCBI 報道，目前只有1 條來自美國的GVM 的全基因組序列（圖1）。

2 小結與展望

綜上所述，我們對12種侵染葡萄的葡萄屬病毒進行了綜述，這是我國首次對該類病毒從生物學特性、分子特征和致病機制3個方面進行綜述，并且基于全長基因組序列對上述12種病毒進行了系統發育分析，明確了12種病毒間的系統發育關系，為后續開展該類病毒的分子變異、流行、致病機制研究奠定了基礎數據。

目前為止，大量研究證明，GVA、GVB、GVD、GVE、GVF 與皺木復合病的發生相關，但是這些研究僅限于生物學的嫁接試驗，基于侵染性克隆單毒源的接種證明還未見報道。上述病毒中目前只有GVA 和GVB 侵染性克隆成功構建[2]，其他病毒均未見有成功構建侵染性克隆的報道，極大地限制了這些病毒致病機制的研究進展，因此，在后續研究中，開展上述病毒侵染性克隆的構建是進行病毒致病機制研究的關鍵。

到目前為止，GVA、GVB、GVE 可通過粉蚧傳播，因此防控這類病毒病防蟲是關鍵，同時，對于果樹病毒病的防控，使用脫毒苗木是最好的防控辦法，因此，建議在葡萄生產中盡量使用脫毒苗木[40]。本文提供的基因組信息，也為從分子水平開展病毒檢測提供了基礎數據，因此，未來對于侵染葡萄的葡萄病毒防控主要將從高靈敏的檢測方法、使用脫毒苗木以及加強種植后田間粉蚧防控著手，同時建議加強其他傳毒介體的調查。