配制酒多糖提取條件優(yōu)化

滕 娟，滕曉燕，史文秀，陳 楠

（江蘇雙溝酒業(yè)股份有限公司，江蘇宿遷 223800)

配制酒，又稱(chēng)調(diào)制酒，是酒類(lèi)里面一個(gè)特殊的品種，不專(zhuān)屬于哪個(gè)酒的類(lèi)別，是混合的酒品。近年來(lái)隨著人們生活水平的提高，在大健康產(chǎn)業(yè)的帶動(dòng)以及健康消費(fèi)理念的推動(dòng)下,保健型配制酒得到較快發(fā)展，由于保健型配制酒中含有有益于人體健康的多糖、皂苷、黃酮類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而比普通白酒更具有養(yǎng)生功效，越來(lái)越被消費(fèi)者所喜愛(ài)。其含有的多糖(polysaccharide)是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，至少由超過(guò)10個(gè)的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，可用通式(C6H10O5)n表示。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。研究證明，多糖能夠促進(jìn)免疫系統(tǒng)功能，讓免疫系統(tǒng)能夠不斷生產(chǎn)自然殺手細(xì)胞、干擾素、白細(xì)胞介素來(lái)摧毀已經(jīng)存在的癌細(xì)胞，進(jìn)而維護(hù)整個(gè)免疫系統(tǒng)的健康平衡。但是關(guān)于配制酒中多糖的檢測(cè)方法還沒(méi)有出臺(tái)針對(duì)性的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各企業(yè)均根據(jù)實(shí)際情況來(lái)制定自己的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)方法都還在不斷摸索與完善中。

本實(shí)驗(yàn)主要運(yùn)用乙醇沉淀法來(lái)進(jìn)行配制酒中多糖的提取，通過(guò)對(duì)提取過(guò)程的分析，可以發(fā)現(xiàn)多糖提取主要涉及乙醇提取濃度、冷藏溫度和水提溫度3個(gè)實(shí)驗(yàn)條件。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)找出最佳乙醇提取濃度、最佳冷藏溫度、最佳水提溫度，從而對(duì)配制酒多糖檢測(cè)的前處理過(guò)程中設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行明確與完善，提高配制酒檢測(cè)中多糖的提取效率，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售白酒及保健型配制酒產(chǎn)品。

試劑及耗材：多糖標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、硫酸、苯酚、無(wú)水葡萄糖等。

儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、控溫醫(yī)用冷藏箱、電爐、溫度計(jì)、移液管等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 理論依據(jù)

1.2.1.1 關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)條件分析

（1）乙醇提取濃度：多糖類(lèi)物質(zhì)由于其分子中含有大量的極性基團(tuán)，與水有較大的親和力，易溶于水而不溶于乙醇等醇類(lèi)物質(zhì)。

（2）冷藏溫度：低溫環(huán)境條件下可使多糖從高濃度的乙醇溶液中析出。

（3）水提溫度：多糖極易溶于熱水。

1.2.1.2 試驗(yàn)原理

（1）采用乙醇沉淀法提取多糖，多糖類(lèi)物質(zhì)由于其分子中含有大量的極性基團(tuán)，與水有較大的親和力，易溶于水而不溶于乙醇等醇類(lèi)物質(zhì)。且多糖極易溶于熱水。隨著乙醇濃度的升高能夠沉淀出的多糖分子量越來(lái)越小，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到85%時(shí)可以沉淀出單糖。

（2）采用硫酸-苯酚法對(duì)提取的多糖進(jìn)行定量，多糖在硫酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物。用紫外分光光度法測(cè)定多糖含量。

1.2.2 試驗(yàn)步驟

試驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：分別將乙醇提取濃度、冷藏溫度和水提溫度其中的一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件作為變量，保持其他實(shí)驗(yàn)條件、試劑及儀器設(shè)備不變的情況下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。再將影響醇沉步驟的兩個(gè)單因素變量進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別找出每個(gè)試驗(yàn)條件中的最佳變量，最后對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行綜合對(duì)比驗(yàn)證。

操作步驟：取供試品1.0 mL，置離心式管中，加入無(wú)水乙醇至乙醇濃度80%，搖勻，冷藏1 h，取出，離心（轉(zhuǎn)速為4000 r/min）20 min，棄去上清液，加熱水1 mL 溶解即得。精確量取上述所得溶液1 mL，加入5 %苯酚溶液（臨用配制），搖勻，再加入硫酸5 mL，搖勻，至沸水浴中加熱20 min，取出，至冰浴中冷卻5 min，以相應(yīng)試劑為空白，利用紫外分光光度計(jì)法在波長(zhǎng)488 nm 處測(cè)定吸光度[1]（注：吸光度與多糖含量成正比，吸光度越高提取效果越好）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 吸光度隨乙醇提取濃度變化

以乙醇提取濃度為變量，保持其他實(shí)驗(yàn)條件不變，將乙醇提取濃度分別調(diào)節(jié)成70%、75%、80%、85%、90%5 個(gè)梯度，每組進(jìn)行3 次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

圖1 吸光度隨乙醇提取濃度變化規(guī)律折線圖

結(jié)果顯示：當(dāng)乙醇提取濃度在70%～80%范圍內(nèi)，吸光度隨乙醇提取濃度的升高而升高；當(dāng)乙醇提取濃度在80%～90%范圍，吸光度達(dá)到最大且趨于穩(wěn)定。

2.1.2 吸光度隨冷藏溫度變化

以冷藏溫度為變量，保持其他實(shí)驗(yàn)條件不變，選取8 ℃、6 ℃、4 ℃、2 ℃、0 ℃、-2 ℃、-4 ℃共7個(gè)冷藏溫度梯度，每組進(jìn)行2次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。

圖2 吸光度隨冷藏溫度影響變化規(guī)律折線圖

結(jié)果顯示：吸光度隨冷藏溫度的降低而升高，當(dāng)冷藏溫度達(dá)到0 ℃時(shí)吸光度達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定。說(shuō)明冷藏溫度在0 ℃及以下時(shí)提取效果最佳。

2.1.3 吸光度隨水提溫度變化

以水提溫度為變量，保持其他實(shí)驗(yàn)條件不變，選取40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃共9 個(gè)溫度梯度，每組進(jìn)行3 次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 吸光度隨水提溫度變化規(guī)律折線圖

結(jié)果顯示：吸光度隨水提溫度的升高而升高，當(dāng)水提溫度升至70 ℃時(shí)達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定，說(shuō)明水提溫度在70 ℃及以上提取效果均較好，但是隨溫度的升高操作難度增大，綜合考慮70 ℃為最佳提取溫度。

2.2 正交試驗(yàn)

以上3 個(gè)單因素條件涉及醇沉與溶解兩個(gè)步驟，影響醇沉的實(shí)驗(yàn)條件為乙醇提取濃度和冷藏溫度；影響溶解的實(shí)驗(yàn)條件為水提溫度，通過(guò)上述試驗(yàn)可確定最佳水提溫度為70 ℃，現(xiàn)將醇沉步驟中的乙醇提取濃度和冷藏溫度兩個(gè)試驗(yàn)條件進(jìn)行兩因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

將表1中9組試驗(yàn)進(jìn)行每組3次平行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果如圖4。

圖4 乙醇提取濃度和冷藏溫度正交試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

表1 乙醇提取濃度和冷藏溫度兩因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知：共9 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，第2組、第5組、第9組提取效果均較好，但第2組標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性較高，所以第2組的試驗(yàn)條件應(yīng)為最佳試驗(yàn)條件，即乙醇提取濃度為85%，冷藏溫度為0 ℃。

綜合單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)可知，各試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合標(biāo)準(zhǔn)要求，說(shuō)明試驗(yàn)準(zhǔn)確可行；在醇沉步驟中配制酒多糖提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為乙醇提取濃度85%，冷藏溫度0 ℃；在水溶提取步驟中最佳水提溫度為70 ℃。

2.3 回收率試驗(yàn)

選取不含多糖的白酒樣品與多糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成多糖含量為500 mg/L 的多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別向A、B、C、D 組加入0.5 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL 的500 mg/L 多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用上述白酒樣品定容至50 mL，配制成5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L 4 個(gè)濃度水平樣品，每個(gè)濃度水平各做6 個(gè)平行，按照上述試驗(yàn)所得的最佳前處理?xiàng)l件進(jìn)行試驗(yàn)，具體試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

從表2 可看出，4 個(gè)濃度水平的回收率為89.58 %～100.67 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04 %～0.08%，均符合《中國(guó)藥典2015 版9101 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》中回收率限值及準(zhǔn)確性的要求。

表2 配制酒多糖提取方法回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論與展望

3.1 明確了配制酒多糖檢測(cè)前處理中多糖提取的最佳實(shí)驗(yàn)條件為乙醇提取濃度85 %，冷藏溫度0 ℃，水提溫度70 ℃。對(duì)配制酒中多糖提取的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在一定程度上完善了配制酒中的多糖檢測(cè)方法。

3.2 從檢驗(yàn)操作準(zhǔn)確性角度考慮，明確具體的試驗(yàn)條件更能夠保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 隨著保健型配制酒市場(chǎng)的日益壯大，消費(fèi)者對(duì)于配制酒中有益成分的關(guān)注也越來(lái)越高，用科學(xué)的理論與實(shí)驗(yàn)方法積極完善配制酒檢測(cè)方法，規(guī)范配制酒檢測(cè)體系，是每一位檢驗(yàn)工作者的責(zé)任，期待配制酒多糖檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)。