低度米酒發酵工藝優化及發酵動力學模型建立

李靜雯，張東亞，陸 洋，許譯文

（貴州省輕工業科學研究所，貴州貴陽 550007）

米酒是我國傳統特色食品，具有較高的營養價值[1]。目前，國內外有關米酒的研究主要集中在發酵工藝條件優化[2]、成分分析[3]、原料分析[1，4]以及酒曲制作及研究[5]等方面，而有關低度米酒的制作工藝及發酵動力學的研究分析較少。

發酵動力學是生化反應工程的基礎內容之一，以研究發酵過程的反應速率和環境因素對速率的影響為主要內容[6]。貴州省輕工業科學研究所聯合多家單位制作的單工位多模態智能發酵罐，其設計是基于發酵過程的工藝控制。因此，通過發酵動力學的研究，可進一步了解各發酵參數之間的關系，為發酵過程的工藝控制、發酵罐的設計放大和利用計算機對發酵過程進行控制提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：糯米，五常市錦鴻米業有限公司；酒曲，昆明市呈貢吉兆酒曲廠。

試劑及耗材：超純水，自產；平板計數瓊脂，上海博微生物科技有限公司；氯化鈉（分析純），成都金山化學試劑有限公司。

儀器設備：Testo 205 便攜式pH 計，德圖儀表（深圳）有限公司；0-50 %手持折光儀，深圳鼎鑫宜；超純水儀，Heal Force Easy15；RE-52A 旋轉蒸發儀，上海亞榮；SPX-150 生化培養箱，上海豫明；JA2003 電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；LS-75HD立式滅菌器，濱江醫療；SW-CJ-2FB超凈工作臺，上海豫明。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程及操作要點

本試驗采用工藝流程：糯米→浸泡→蒸煮→加漿→拌曲→發酵→過濾→殺菌→成品

操作要點：

（1）浸泡：浸泡糯米水溫在20～30 ℃之間，浸泡時間為7～12 h。

（2）加漿量：加漿量為米重的2.5倍。

（3）拌曲：拌曲溫度應在35 ℃±2 ℃。

（4）發酵：發酵前2 d，每24 h 攪拌1 次，發酵48 h后進行密閉發酵。

（5）過濾：先使用50 目網篩過濾，再使用100 目的尼龍布進行過濾即得。

（6）殺菌：采用超聲波（15 min）與脈沖強光協同紫外（10 min）聯合殺菌。

1.2.2 單因素試驗

將低度米酒的發酵基礎條件設為酒曲添加量0.7%，發酵溫度30 ℃，發酵時間為7 d，以感官評分作為評價指標，分別對酒曲添加量0.3 %、0.5 %、0.7%、0.9%；發酵溫度25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃；發酵時間5 d、7 d、9 d、11 d 進行試驗，觀察不同條件對低度米酒感官評分的影響。

1.2.3 正交試驗

為確定低度米酒的最佳發酵工藝，經單因素分析，選擇影響米酒品質的因素，進行正交試驗。

1.2.4 發酵過程參數測定

在最佳工藝條件下，每24 h 進行菌落總數、糖度、酒精度、pH值的測定，具體檢測方法如下。

菌落總數測定：參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行測定。

酒精度測定：參考GB 5009.225—2016《食品國家安全標準酒中乙醇濃度的測定》進行測定。

pH值測定：采用便攜式pH計進行測定。

TSS測定：采用折光儀測定，并以°Bx表示。

1.2.5 感官品評方法

感官品評方法首先用0～4 評判法[7]確定各指標的權重，再利用模糊數學感官評價法[8]對發酵型低度米酒進行品評，所有的評價指標分為4 個等級：優秀(90 分)、良好(80 分)、中等(70 分)、較差(60分)。感官要求參考T/GZSX 017—2020《貴州米酒》中發酵型米酒感官品評要求，詳見表1。

表1 米酒(發酵型)感官要求

1.2.6 發酵動力學模型的建立

根據低度米酒發酵過程中菌落生長情況、酒精含量、pH 生成和TSS 消耗建立菌群生長、酒精生成、酸性物質生成和TSS消耗的動力學模型。

1.3 數據處理

運用Origin 2021 軟件進行繪圖，并對低度米酒發酵過程中菌落總數、酒精含量、酸性物質生成量、TSS 消耗量進行非線性擬合。通過回歸求解動力學模型參數，建立菌落總數生長、酒精生成、酸性物質生成和TSS 消耗的動力學模型方程。利用Excle進行數據統計，SPSS 26.0進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 評價指標權重分析

將各指標之間進行兩兩比較，如果重要程度較大則記為1，否則為0，指標自身不進行比較[8]。指標權重評判共6 人(3 男，3 女)，評價結果如表2所示。

表2 評價指標權重分布

綜上所述，將低度米酒評價指標權重計為N=(0.23,0.26,0.31,0.20)。感官品評時所有參評人員(8人)只給出每個指標的優秀、良好、中等、較差共4個等級的評判，最終進行計算統計。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 加曲量對感官品評的影響

由圖1 可知，加曲量為0.3%時，由于用曲量少發酵不充分，TSS(5.5 %)、酒精度(6.1 %vol)較其他組低，感官上風味及滋味偏向甜酒釀。

圖1 加曲量對感官品評的影響

隨著酒曲添加量的增加，在0.7 %時發酵的米酒，米香較好，且口感好，因此適宜的酒曲添加量為0.7%。對加曲量進行顯著性分析，結果表明，加曲量在0.3 %～0.7 %之間感官評分結果差異顯著（p＜0.05），其他加曲量之間差異不顯著（p＞0.05），通過該試驗確定以加曲量0.6%、0.7%、0.8%作為正交試驗的3個水平。

2.2.2 發酵溫度對感官品評的影響

由圖2 可知，當發酵溫度在40 ℃時，由于溫度過高，導致米酒苦味重，且酸度較大(pH 3.46)，因此感官評分較低(73.49 分)。而發酵溫度低于30 ℃時，微生物生長較為緩慢，外觀較黏稠，因此感官評分較低(76.98分)。

圖2 發酵溫度對感官評分的影響

經顯著性分析，40 ℃下的感官評分與30 ℃、35 ℃的感官評分差異顯著（p＜0.05）。發酵溫度在25 ℃、30 ℃、35 ℃時，感官評分差異不顯著(p＞0.05)，綜上所述，試驗確定以28 ℃、30 ℃、32 ℃作為正交試驗發酵溫度的3個水平。

2.2.3 發酵時間對感官評分的影響

由圖3 可知，在一定溫度和酒曲添加量下，隨著發酵時間的延長，感官評分呈現先增加后降低的趨勢。

圖3 發酵時間對感官評分的影響

經數據分析，發酵時間之間差異不顯著(p＞0.05)，發酵7 d 和發酵11 d 之間差異顯著（p＜0.05）。當發酵時間為5 d 時，由于發酵時間較短，產生的酒度低，米香淡，發酵時間延長至11 d 時，其酸度增加，苦味較突出[9]，發酵時間過長或過短所得成品感官均較差。因此，選擇發酵時間6 d、7 d、8 d作為正交試驗發酵時間的3個水平。

2.3 正交試驗結果與分析

為確定低度米酒的最佳配方，在單因素試驗的基礎上，選取影響低度米酒品質的3 個主要因素，即加曲量(A)、發酵溫度(B)和發酵時間(C)，采用L9(33)正交實驗法，對各因素水平的設置見表3。

表3 各因素水平對照表

根據上表進行正交試驗，正交試驗結果及極差分析見表4。

表4 正交試驗結果及極差分析

正交實驗方差分析結果見表5。

表5 正交試驗方差分析結果

由表4 和表5 可知，對低度米酒發酵影響順序為發酵時間(C)＞發酵溫度(B)＞加曲量(A)，最優水平為C2B1A2，即發酵時間7 d，發酵溫度28 ℃，加曲量0.7 %，此時感官評分最高為82.08 分，此時TSS 13.5°Bx，pH3.98，酒精度11.4%vol。

2.4 重復試驗結果

將感官評分差異不顯著的A2B1C2與A2B3C1進行重復試驗，試驗結果見表6。

表6 重復試驗結果

由表6 可知，A2B1C2感官評分略高于A2B3C1，因此最終確定最佳發酵工藝為發酵時間7 d，發酵溫度28 ℃，加曲量0.7%。

2.5 低度米酒主要指標變化情況

2.5.1 發酵過程主要指標的檢測

基于最優工藝條件，對發酵過程主要指標(菌落總數、酒精度、pH 值、TSS)進行測定，變化曲線見圖4。

圖4 低度米酒發酵過程主要指標變化圖

由圖4 可知，從第5 天開始，TSS 含量減少趨勢緩慢，并逐漸趨于穩定，這可能是由于酵母菌也在這一時期開始逐漸衰亡，底物消耗逐漸減弱，這也預示著發酵基本完成。發酵過程中酒精度含量在發酵前2 d 變化很小，一方面是由于酵母菌處于生長適應階段，還未完全進行產酒精作用；另一方面是由于前2 d 進行有氧發酵，此時糖化酶作用于發酵醪中的淀粉、糊精將其水解生成糖類、有機酸類物質，因此糖度較高，酒精度低，pH 值下降快，有氧微生物繁殖速度較快。

從發酵第3 天開始，進入無氧發酵階段，該階段糖度下降快，酒精度快速上升，又有發酵醪中的蛋白質在蛋白酶的作用下，水解生成小分子的蛋白質、肽和各種氨基酸的反應，這些水解產物，一部分被酵母細胞吸收合成菌體，另一部分則發酵生成了酒精和二氧化碳，還產生副產物雜醇油、甘油等，該過程pH 值下降程度變緩，酵母菌開始大量繁殖，將糖轉化為酒精，導致酒精度大幅度上升，在發酵第7 天酒精度達到最大值，為11.6 %vol。從酒精度、TSS 含量、菌落總數以及pH 值隨發酵的變化上看，四者之間相互聯系，變化符合發酵規律。

2.5.2 菌落總數生長模型建立

菌群的生長動力學模型大多使用Monod 和Logistic 方程。Monod 方程表述簡單、應用范圍廣泛，但僅適用于細胞生長較慢和細胞密度較低的環境下[10]；而Logistic 方程描述菌體生長情況，可以反映出發酵過程中因菌體的增加而抑制自身生長的作用，對擬合菌體生長過程具有一定的適用性[11]，因此通過Logistic方程進行擬合。

式中：Y 表示發酵過程中菌落總數，×106cfu/mL；A1表示初始菌落總數，×106cfu/mL；A2表示最終菌落總數，×106cfu/mL；x表示發酵時間，d；x0、p 為方程系數。

通過origin2021 軟件對菌體數量和方程式(1)進行擬合，得到A1=2.63538，A2=7.06471，x0=2.81754，p=6.182，帶入式(1)得菌落總數隨發酵過程變化的動力學模型式(2)。

菌落總數生長試驗值與預測值模型擬合曲線如圖5所示。

圖5 菌落總數擬合曲線

在低度米酒的發酵過程中，菌群的生長代謝決定了產物的生成以及基質的消耗。由于糯米中富含支鏈淀粉[14]，因此前兩天有氧發酵階段，菌群主要產生糖化酶將淀粉轉化為糖元，這與TSS 消耗情況相對應。由圖5 可知，發酵過程中菌落總數的變化曲線的擬合度較好，Logistic 模型R2=0.98669，表明該模型能較好的反映菌落總數的生長情況。

2.5.3 酒精生成發酵動力學模型建立

酒精的生成是微生物主要能量代謝的直接結果，產物的生成和細胞的生長是同步的和完全偶聯的[12]。因此，利用與菌落總數相同的方程進行擬合。

式中：Y 表示發酵過程中酒精度，%vol；A1表示初始酒精度，%vol；A2表示最終酒精度，%vol；x 表示發酵時間，d；x0、p 為方程系數。

通過origin 2021 軟件對酒精度和方程式（3）進行擬合，得到A1=0.85547，A2=11.6873，x0=3.56228，p=7.78307，帶入式（3）得酒精度隨發酵過程變化的動力學模型式（4）。

酒精生成試驗值與預測值模型擬合曲線如圖6所示。

圖6 酒精度擬合曲線

由圖6 可知，由于酒曲中含有多種菌群，因此前2 d 有氧發酵階段依然有酒精生成，進入無氧發酵階段酒精生成速率加快，當菌群進入到穩定期和衰亡期，產酒精作用逐步減緩，曲線平緩下降[15]。發酵過程中酒精度的變化曲線的擬合度較好，Logistic模型R2=0.98922，表明該模型能較好的模擬酒精的生成。

2.5.4 酸類物質生成動力學模型建立

酸類物質的生成既與菌體生長速率有關，也與菌體濃度有關。發酵過程中由于微生物對培養基中碳源、氮源等的利用，隨著有機酸或氨基氮的積累，會使酸度產生一定的變化[6]。因此，采用Boltzmann模型建立該方程。

式中：Y 表示發酵過程中pH 值；A1表示初始pH 值；A2表示最終pH值；x表示發酵時間，x0、dx為方程系數。

通過origin 2021 軟件對pH 值和方程式（5）進行擬合，得到A1=4.50978，A2=3.97569，x0=3.01584，dx=0.92478，帶入式（5）得pH 值隨發酵過程變化的動力學模型式（6）。

酸類物質生成試驗值與預測值模型擬合曲線如圖7所示。

圖7 酸類物質生成發酵動力學模型

酸類物質的生成與微生物生長部分偶聯，產物是能量代謝的間接結果[12]。在微生物的作用下，有氧發酵過程中根霉及乳酸菌分解產生乳酸等有機酸，使得pH 值快速下降；無氧發酵過程中酵母菌的酒精發酵作用將有機酸降解為酒精等小分子物質，因此pH值逐漸下降速率變緩[13]。由圖7可知，發酵過程中酸類物質生成的變化曲線的擬合度較好，Boltzmann 模型R2=0.99194，表明該模型能較好的模擬酸類物質的生成。

2.5.5 基質消耗動力學模型建立

在低度米酒的發酵過程中，TSS 的消耗模型屬于底物消耗，基質底物是菌種生長代謝的物質基礎，又涉及產物的合成。在微生物發酵過程中，主要消耗在三個方面：一是用于合成新的細胞物質，二是用于合成代謝產物，三是提供細胞生命活動的能量[6，12]。通過物料平衡，利用Boltzmann模型建立方程如下。

式中：Y 表示發酵過程中TSS 的值，°Bx；A1表示初始TSS 的值，°Bx；A2表示最終TSS 的值，°Bx；x 表示發酵時間，x0、dx為方程系數。

通過origin 2021 軟件對TSS 和方程式（7）進行擬合，得到A1=28.66602，A2=13.55812，x0=2.5768，dx=0.7125，帶入式（7）得TSS 隨發酵過程變化的動力學模型式（8）。

圖8 基質消耗反應動力學模型

TSS 中大部分為可溶性糖[16]，糖作為微生物生長代謝必須的碳源，其生成與糯米淀粉水解有關[17]，主要是由于在前48 h 有氧發酵階段，酒曲中的根霉、毛霉等大量生長繁殖，產生糖化酶，將糯米中的支鏈淀粉轉化為糖元，為后續酵母、細菌等利用其產生酒精提供充足的基質。在擬合方程中，選擇了擬合度較高的Boltzmann 方程進行擬合，其R2=0.99631，表明該模型能較好的模擬基質的消耗。

3 結論與討論

通過對低度米酒工藝的探究，確定了最佳發酵工藝為加曲量0.7%，發酵溫度28 ℃，發酵時間7 d，進行重復試驗后監測其發酵過程菌落總數、酒精度、pH值和TSS的變化，并進行了模型建立，且4個監測值的模型擬合程度較好，分別為0.98669、0.98922、0.99194 和0.99631。但是由于監測設備受限，未進行含氧量（DO）的監測，且由于酒曲中菌群復雜，無法利用比濁度進行菌液含量的測定，因此試驗僅是對低度米酒發酵過程進行了粗略的檢測，可作為發酵罐設計所需的基礎發酵工藝參考數據。