22種氨基酸衍生化串聯質譜高通量檢測方法的建立及其在遺傳代謝病中的應用

丁 麗，張 瑞

空軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科，陜西西安 710032

先天性代謝異常又稱遺傳代謝病，大多屬于隱性基因遺傳性疾病，多數在嬰兒期內起病，發病的機制復雜，尤其是臨床表現的多樣性和檢測指標缺乏特異性導致遺傳代謝病的精準診斷和治療困難[1-3]。遺傳代謝病的診斷和治療依賴于醫生的臨床經驗和一些非特異性的生化指標,多數情況下，臨床醫生只能根據經驗推測遺傳代謝病的可能性而難以做出具體病因診斷[4-5]。近年來，隨著臨床診斷學的不斷發展，液相色譜-質譜分析技術在臨床診斷尤其是遺傳代謝病篩查中的應用越來越廣泛[6-8]，但是目前遺傳代謝病篩查大部分只檢測13種氨基酸，本研究利用衍生化串聯質譜法建立了22種氨基酸全血檢測方法，擴大了氨基酸的檢測種類，將其運用于新生兒及兒童遺傳代謝病篩查，并分析該檢測方法的各種影響因素，為相關疾病診斷的進一步發展提供科學依據?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年5月至2018年1月西部5省部隊在空軍軍醫大學第一附屬醫院自愿選擇衍生化串聯質譜篩查的2 869例各項醫學檢測指標均正常的3 d至1歲新生兒及兒童為研究對象。出生后3～28 d設為新生兒組(n=1 926)，男999例,女927例；>28 d至1歲設為兒童組(n=943)，男490例，女453例。通過檢測健康新生兒及兒童外周血中22種氨基酸濃度來確定本實驗室的正常上、下限值，22種氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、同型半胱氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、六氫哌啶羧酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。本研究雖然同時得到了22種氨基酸的結果，但是由于論文篇幅有限，為了結果的系統性、科學性、可比性，選擇甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸為代表進行分析討論。

1.2標本收集與保存 兒童組：研究對象于上午7：00-9:00空腹采集末梢血滴于專用采血濾紙上，形成幾個均勻血斑，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內，-20 ℃冰箱保存待檢。新生兒組：新生兒出生3 d后，哺乳多次，采足后跟血于專用采血濾紙上，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內，-20 ℃冰箱保存待檢。

1.3儀器與試劑 API3200串聯質譜儀購自美國AB生物應用系統公司，高效液相色譜儀購自美國安捷侖公司(Agilent1200)，96孔板加熱吹干裝置購自杭州奧盛公司(MD200)。甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等試劑購自美國Thermo Fisher公司，均為色譜級。將正丁醇和乙酰氯按體積比9∶1配制成3 mol/L的鹽酸正丁醇溶液作為衍生化試劑備用，96孔板購自博奧公司。實驗中所用氮氣的純度在99.9%以上。12種氨基酸內標，包括丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸，用甲醇溶解并稀釋配制成萃取液,4 ℃保存,1個月內用完。

1.4檢測方法 (1)樣本處理方法：用打孔器在干血濾紙片上制直徑3 mm的圓形血濾紙片(4個質控、1個空白),將其置于96孔板中,每孔加入1.3中制備的萃取液100 μL,室溫密封震蕩15 min萃取血片中的22種氨基酸,然后轉移萃取液至另一個96孔板,40 ℃加熱氮氣吹干,再加入60 μL1.3中制備的衍生化試劑，Teflon膜覆蓋,置于65 ℃恒溫箱內反應20 min,隨后40 ℃氮氣吹干,再加入100 μL 80%乙腈溶解,鋁膜覆蓋,串聯質譜儀檢測。(2)儀器設置狀態：乙腈作為流動相,設置液相色譜的流速為300 μL/min,進樣量為20 μL，質譜檢測中性氨基酸采用中性丟失掃描[中性丟失片斷質荷比為102 Da,掃描范圍為140～280 m/z]和多反應監測2種模式,每個樣本22種氨基酸檢測只需要2 min。(3)資料分析：采用美國AB生物應用系統公司ChemoView 2.0.2軟件進行定量分析,根據經過衍生化的22種氨基酸及其同位素內標的離子峰強度,得出所測樣本中22種氨基酸的濃度。

1.5影響因素的考察

1.5.1抗凝劑使用對檢測結果的影響 采用3種方式[直接采末梢血于干濾紙片上、采靜脈血于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的真空管混勻后滴于干濾紙片上、采靜脈血于含有肝素抗凝劑的真空管混勻后滴于干濾紙片上]來考察抗凝劑的使用對本方法的檢測結果是否有影響。

1.5.2標本保存時間對檢測結果的影響 將標本自然晾干放置1、7、14、21、28、35 d后的檢測結果進行比較，考察標本保存時間對檢測結果的影響。

1.5.3不同氮氣吹干時間對檢測結果的影響 在50 ℃、0.2 MPa氮氣吹干條件下考察氮氣吹干10、15、20 min對檢測結果的影響。

1.5.4內標液保存時間對檢測結果的影響 選擇內標液于4 ℃保存1、7、14、21、28、42、56 d后進行檢測，考察內標液保存時間對檢測結果的影響。

1.6方法性能驗證 參照美國食品及藥物管理局的生物分析方法[9]，驗證建立的衍生化串聯質譜法檢測22種氨基酸的基本性能。

1.6.1定量檢出限 系列稀釋標準品，每個濃度重復檢測5次，將同時滿足變異系數(CV)<20.0%,偏倚<20.0%。

1.6.2精密度評價 使用高、中、低3個濃度的混合全血作為待測樣本，分別同時檢測20次，評價批內精密度。將混合全血制成的濾紙片在-20 ℃保存，連續檢測5 d，每天重復3次，評價批間精密度。

1.6.3回收試驗 在已知濃度的全血中同時加入2種不同濃度的標準品作為待測樣本，每份樣本重復檢測3次，取均值，并與理論值進行比較，計算回收率?；厥章试?0.0%～120.0%判斷為可接受。

1.6.4準確度評價 取2份已知濃度的全血標本，重復檢測3次取均值，偏倚<10.0%判斷為可接受。

2 結 果

2.1抗凝劑使用對氨基酸檢測結果的影響 EDTA可使檢測結果降低，肝素抗凝劑可使檢測結果升高，故臨床標本采集不宜使用抗凝血，使用新鮮末梢血制成的干血片可以用于氨基酸的檢測。使用不同抗凝劑的結果見表1。

表1 抗凝劑使用對氨基酸檢測結果的影響

2.2標本保存時間對檢測結果的影響 部分氨基酸指標隨著保存時間的延長而降低，故建議4 ℃保存標本并在2周以內檢測。標本保存時間對檢測結果的影響見表2。

表2 標本保存時間對氨基酸檢測結果的影響

2.3不同氮氣吹干時間對檢測結果的影響 吹干10 min檢測指標普遍偏低，吹干20 min氨基酸指標偏移較小，選擇20 min吹干氨基酸均較為理想。不同氮氣吹干時間條件下的檢測結果見表3。

表3 不同氮氣吹干時間對氨基酸檢測結果的影響

2.4內標液保存時間對檢測結果的影響 同位素內標復溶后會逐漸分解或衰減，致使標準降低，檢測結果增高，1個月左右個別指標變化達10.0%，建議同位素內標復溶后盡快使用，4 ℃冰箱保存效期為1個月左右。內標液在不同保存時間下的實驗結果見表4。

表4 內標液保存時間對氨基酸檢測結果的影響

2.5方法性能驗證

2.5.1定量檢出限 衍生化串聯質譜法檢測22種氨基酸的定量檢出限分別為：丙氨酸6.0 μmol/L，精氨酸0.3 μmol/L，天冬氨酸0.3 μmol/L，瓜氨酸0.5 μmol/L，半胱氨酸0.4 μmol/L，谷氨酰胺1.0 μmol/L，谷氨酸3.0 μmol/L，甘氨酸10.0 μmol/L，同型半胱氨酸4.0 μmol/L，組氨酸2.0 μmol/L，亮氨酸3.0 μmol/L，賴氨酸0.8 μmol/L，甲硫氨酸0.8 μmol/L，鳥氨酸1.0 μmol/L，苯丙氨酸1.0 μmol/L，六氫哌啶羧酸2.0 μmol/L，脯氨酸10.0 μmol/L，絲氨酸1.0 μmol/L，蘇氨酸1.0 μmol/L，色氨酸2.0 μmol/L，酪氨酸1.5 μmol/L，纈氨酸3.0 μmol/L。

2.5.2精密度評價 檢測高、中、低3個濃度的混合全血待測樣本中22種氨基酸用于評估氨基酸的精密度，高濃度混合全血待測樣本批內CV為5.3%～7.2%，中濃度混合全血待測樣本批內CV為5.8%～7.4%，低濃度混合全血待測樣本批內CV為5.6%～7.9%；高濃度混合全血待測樣本批間CV為7.1%～8.1%，中濃度混合全血待測樣本批間CV為7.4%～8.3%，低濃度混合全血待測樣本批間CV為7.3%～8.6%。經統計學分析，男、女氨基酸濃度差異無統計學意義(P>0.5)。

2.5.3回收試驗 考察加入高、低濃度標準品的待測樣本回收率。當加入低濃度標準品時回收率分別為丙氨酸96.1%，精氨酸97.4%，天冬氨酸97.0%，瓜氨酸97.2 %，半胱氨酸97.0%，谷氨酰胺93.4%，谷氨酸96.2%，甘氨酸95.8%，同型半胱氨酸96.2%，組氨酸95.9%，亮氨酸96.4%，賴氨酸96.8%，甲硫氨酸97.2%，鳥氨酸96.5%，苯丙氨酸96.0%，六氫哌啶羧酸96.4%，脯氨酸96.3 %，絲氨酸97.4%，蘇氨酸97.1%，色氨酸96.5%，酪氨酸96.3%，纈氨酸 96.1%。加入高濃度標準品時回收率為丙氨酸97.5%，精氨酸97.8%，天冬氨酸98.0%，瓜氨酸97.7%，半胱氨酸97.5%，谷氨酰胺97.2%，谷氨酸98.1%，甘氨酸97.0%，同型半胱氨酸97.4%，組氨酸97.3%，亮氨酸97.8%，賴氨酸97.5%，甲硫氨酸97.9%，鳥氨酸97.2%，苯丙氨酸97.1%，六氫哌啶羧酸97.6%，脯氨酸97.9%，絲氨酸98.1%，蘇氨酸97.8%，色氨酸97.2%，酪氨酸97.4%，纈氨酸97.3%?？傮w樣本的加標回收率為96.1%～98.1%。

2.5.4準確度評價 標本1的偏倚分別為丙氨酸6.1%，精氨酸7.8%，天冬氨酸7.8%，瓜氨酸7.6%，半胱氨酸0.0%，谷氨酰胺5.3%，谷氨酸4.1%，甘氨酸4.1%，同型半胱氨酸4.5%，組氨酸7.4%，亮氨酸8.2%，賴氨酸6.2%，甲硫氨酸6.3%，鳥氨酸5.8%，苯丙氨酸9.3%，六氫哌啶羧酸8.9%，脯氨酸5.8%，絲氨酸6.4%，蘇氨酸9.5%，色氨酸6.0%，酪氨酸5.1%，纈氨酸7.4%。標本2的偏倚分別為丙氨酸5.1%，精氨酸4.9%，天冬氨酸6.9%，瓜氨酸9.7%，半胱氨酸10.0%，谷氨酰胺5.5%，谷氨酸3.1%，甘氨酸9.3%，同型半胱氨酸4.7%，組氨酸7.2%，亮氨酸4.6%，賴氨酸5.5%，甲硫氨酸4.4%，鳥氨酸5.7%，苯丙氨酸8.7%，六氫哌啶羧酸5.0%，脯氨酸4.5%，絲氨酸4.2%，蘇氨酸5.6%，色氨酸5.1%，酪氨酸5.5%，纈氨酸5.2%。2個標本的偏倚均<10.0%，準確度判斷為可接受。

2.6實驗室22種氨基酸參考區間的建立 采用本實驗室建立的衍生化串聯質譜法在上述優化條件下對2014年5月至2018年1月2 869例西部五省自愿在本院篩查的新生兒及兒童全血標本進行22種氨基酸檢測，通過計算各指標的2.5%～97.5%百分位數初步建立本實驗室新生兒及兒童全血中22種氨基酸的健康人群參考范圍，結果為丙氨酸88.0～664.0 μmol/L,精氨酸0.0～18.8 μmol/L,天冬氨酸0.0～58.0 μmol/L,瓜氨酸3.4～25.1 μmol/L,半胱氨酸0.0～3.1 μmol/L,谷氨酰胺22.0～204.2 μmol/L,谷氨酸87.0～474.0 μmol/L,甘氨酸125.0～750.0 μmol/L,同型半胱氨酸0.0～28.7 μmol/L,組氨酸31.5～214.6 μmol/L,亮氨酸52.2～286.0 μmol/L,賴氨酸7.3～119.8 μmol/L,甲硫氨酸8.4～58.2 μmol/L,鳥氨酸18.3～122.6 μmol/L,苯丙氨酸20.9～137.0 μmol/L,六氫哌啶羧酸110.0～771.0 μmol/L,脯氨酸317.0～2186.0 μmol/L,絲氨酸48.0～239.0 μmol/L,蘇氨酸16.0～116.0 μmol/L,色氨酸4.0～72.0 μmol/L,酪氨酸15.0～178.0 μmol/L,纈氨酸60.0～265.0 μmol/L。

3 討 論

作為蛋白質分子的基本單位，氨基酸無疑是構成人體最基本的物質之一，其重要性使其一直是科學研究領域的熱點[10]。隨著科學技術的不斷進步，氨基酸檢測技術也在不斷發展，其中液相色譜串聯質譜的發展是最典型的代表[11]。液相色譜串聯質譜技術主要是運用液相色譜將待測樣本中的多種成分進行分離，再根據被測物質在質譜中被離子化的特定質荷比的不同帶電粒子,根據特征離子的質量色譜圖及其檢測的離子峰強度,獲得待測化合物的相對分子質量、分子式[12-13]。衍生化串聯質譜法能在2 min內完成1個標本中22種氨基酸濃度的分析,通過對這些產物濃度的分析,對氨基酸代謝紊亂、有機酸代謝紊亂等多種遺傳代謝病進行篩查和診斷[14-16]。不斷發展的氨基酸檢測技術為相對快速診斷遺傳代謝病以指導臨床治療提供了更多的可能性[17-20]。本研究建立本實驗室22種氨基酸的檢測方法衍生化串聯質譜法，并考察實驗過程的影響因素，研究結果表明，樣本處理過程的最佳條件為：使用新鮮末梢血制成的干血片于4 ℃保存標本2周以內檢測，氮氣吹干20 min，同位素內標復溶后盡快使用，4 ℃冰箱保存效期為1個月左右。本方法定量檢出限為0.3～10.0 μmol/L；批內CV為5.3%～7.9%,批間CV為7.1%～8.6%，經統計學分析,男、女氨基酸濃度差異無統計學意義(P>0.5)。加標回收率為96.1%～98.1%，偏倚<10.0%。通過分析2014年5月至2018年1月采集的2 869例新生兒及兒童全血中的氨基酸濃度，建立本實驗室新生兒及兒童全血中22種氨基酸的健康人群參考范圍。本研究建立的22種氨基酸快速檢測方法衍生化串聯質譜法將為臨床醫生精準診療遺傳代謝病提供更多的科學依據。