圍生期孕婦B族鏈球菌篩查方法學探討及血清型耐藥性分析

王 林，段雯婷，樊清清，王 維

陜西省西安市第一醫院：1.檢驗科；2.心血管內科；3.藥劑科，陜西西安 710002；4.陜西省西安市兒童醫院檢驗科，陜西西安 710003

B族鏈球菌(GBS)，又稱無乳鏈球菌，是一種常見的革蘭陽性球菌，在直腸和陰道中正常寄居，屬條件致病菌，一般健康人群感染GBS并不致病[1-2]。GBS是導致圍生期孕婦和新生兒普遍感染的致病菌，除可引起孕婦產褥感染、胎膜早破、胎兒早產、流產外，孕婦在分娩中也可能將此菌傳遞給新生兒，導致新生兒肺炎、腦膜炎、敗血癥，甚至死亡[3-4]。因此，早期篩查GBS并有針對性地運用抗菌藥物對圍生期孕婦和新生兒至關重要[5]。本研究選取2018年1月至2020年8月于西安市第一醫院就診的874例圍生期孕婦作為研究對象，對GBS感染的菌株篩查方法、血清型、耐藥性及孕婦臨床結局進行分析，為更準確、快速鑒定GBS及合理運用抗菌藥物提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取西安市第一醫院2018年1月至2020年8月產科門診及住院收治的35～37周孕婦874例為研究對象。納入標準：所有孕婦1周內未使用抗菌藥物[6]；患者及其家屬對本研究均知情同意。孕婦年齡22～41歲，平均(26.9±2.2)歲。用無菌拭子于生殖道低位1/3處，沿陰道壁輕輕旋轉取孕婦生殖道拭子標本，于肛門括約肌以上2～5 cm處沿腸壁輕輕旋轉取直腸拭子標本，得到標本后立即送檢。

1.2儀器與試劑 實驗儀器包括抗州安杰思科技有限公司AFD9600熒光定量PCR儀，德國布魯克MALDI-TOF基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，法國梅里埃VITEK2-Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀，CO2培養箱。試劑材料包括GBS PCR檢測試劑盒[博爾誠(北京)科技有限公司]，GBS篩查培養基(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，GBS血清分型試劑(丹麥國立血清研究所)，VITEK2 配套藥敏卡GP67[最低抑菌濃度(MIC)法，法國梅里埃公司]。

1.3方法

1.3.1GBS鑒定 (1)顯色培養加鑒定法。將生殖道和直腸分泌物標本分別接種于GBS顯色平板，并分區畫線，35 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h，挑取淺粉色至紅色可疑菌落采用MALDI-TOF基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀及VITEK2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀進行分析鑒定。如果24 h未見典型菌落，可延長培養時間至48 h。(2)熒光定量PCR法。用生理鹽水將生殖道和直腸分泌物標本洗脫混勻，根據試劑盒說明書提取細菌DNA，制作PCR檢測模板。

1.3.2血清型鑒定 采用乳膠凝集法，按照試劑說明書對 GBS菌株進行血清型鑒定，30 s內記錄結果。

1.3.3藥敏試驗 將陽性菌落稀釋至0.5麥氏單位，采用上機MIC法，經VITEK2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀對青霉素、左氧氟沙星、替加環素、頭孢曲松、四環素、氨芐西林、萬古霉素、紅霉素、利奈唑胺、克林霉素、頭孢吡肟進行藥敏試驗。

2 結 果

2.1顯色培養加鑒定法和熒光定量PCR法陽性檢出率比較 顯色培養加鑒定法耗時24 h，陽性檢出率為6.41%(56/874)；熒光定量PCR法耗時4 h，陽性檢出率為8.92%(78/874)。兩者陽性檢出率比較，差異有統計學意義(P=0.048)。

2.2孕婦臨床結局分析 874例孕婦中有33例發生胎兒窘迫、孕婦敗血癥、新生兒敗血癥、早產、胎膜早破等異常情況，其中28例經熒光定量PCR法檢測GBS為陽性,19例經顯色培養法檢測GBS為陽性，差異有統計學意義(P=0.014)。

2.3孕婦定植GBS菌株的血清型分布 78株孕婦定植的GBS共檢出4種血清型，分別為Ⅲ型(40株，51.28%)、Ⅰb型(16株，20.51%)、Ⅰa型 (13株，16.67%)、Ⅴ型(9株，11.54%)。

2.4藥敏試驗結果 33株陽性分離株藥敏試驗結果顯示，GBS對萬古霉素、利奈唑胺、替加環素、頭孢吡肟、頭孢曲松、氨芐西林、青霉素、四環素敏感性較高，對克林霉素、左氧氟沙星、紅霉素敏感性較低。見表1。

表1 GBS陽性分離株的藥敏試驗結果(%)

2.5GBS耐藥性與血清型的相關性 克林霉素、左氧氟沙星耐藥性與血清型差異有統計學意義(P<0.05)，血清型Ⅲ、Ⅰb、Ⅴ型耐藥性較高。見表2。

表2 GBS耐藥性與血清分型的相關性

3 討 論

GBS寄生于健康人下消化道與泌尿生殖道中，為條件致病菌，現已證實GBS是造成圍生期母嬰感染的主要致病菌之一[7-8]。美國疾病預防控制中心(CDC)制定的圍生期GBS防治指南指出，在妊娠末期進行GBS篩查，對陽性患者采取積極預防和治療措施可有效降低GBS感染[9-10]。

GBS篩查方式包括顯色培養法、熒光定量PCR法、免疫法等。顯色培養法是診斷GBS的常規方法，但需24～48 h，耗時較長，同時易出現假陰性結果。GBS篩查培養基加入了顯色底物，經24 h培養，若長出淺粉色至紅色菌落，說明有GBS生長，容易辨別。熒光定量PCR法檢測GBS靈敏度高，特異度強，重復性好，耗時短，操作方便，但對實驗人員和設備要求較高。本研究對874例35～37周孕婦直腸-生殖道拭子標本分別應用GBS顯色培養加鑒定法(MALDI-TOF基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀及VITEK2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析儀)和熒光定量PCR法檢測GBS。結果顯示，顯色培養加鑒定法耗時24 h，陽性檢出率為6.41%，而熒光定量PCR法僅耗時4 h，陽性檢出率為8.92%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)，熒光定量PCR法優勢明顯,此結果與國內其他研究結果一致[11-12]。對此次接受檢查的孕婦進行追蹤統計顯示，33例發生異常情況的孕婦，28例經熒光定量PCR法檢測GBS為陽性，19例經顯色培養加鑒定法檢測GBS為陽性，差異有統計學意義(P<0.05)，說明熒光定量PCR法GBS檢出陽性符合率高于顯色培養及鑒定法。

本研究結果顯示，孕婦所定植的GBS共檢出4種血清型，分別為Ⅲ型(51.5%)、Ⅰb型(21.2%)、Ⅰa型 (15.2%)、Ⅴ型(12.12%)，比例與其他文獻報道的GBS血清分型有差異[13]，提示GBS分布存在地域差異。針對GBS感染的孕婦，臨床上多根據經驗使用青霉素、氨芐西林等進行預防治療，對青霉素過敏的患者，則使用克林霉素、紅霉素治療。近年來隨著抗菌藥物的大量使用，耐藥株逐漸增多[14-15]。本研究藥敏試驗結果顯示，GBS對萬古霉素、利奈唑胺、替加環素、頭孢吡肟、頭孢曲松、氨芐西林、青霉素、四環素敏感性較高，分別為100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、100.00%、82.05%，對克林霉素、左氧氟沙星、紅霉素敏感性較低，分別為50.00%、50.00%、0.00%，此結果與其他地區GBS藥敏結果報道略有不同[16-17]，提示感染的GBS菌株在不同地區存在差異性。因此，對于圍生期孕婦GBS感染者，應根據藥敏試驗結果及時調整治療方案，以提高治愈率。據文獻報道，GBS耐藥性與其血清分型、含有耐藥基因等因素密切相關[18]，本研究結果顯示，Ⅲ、Ⅰb、Ⅴ型3種血清型耐藥性較廣泛，與Ⅰa型差異有統計學意義(P<0.05)，可能是GBS產生耐藥性的主要原因。

綜上所述，圍生期孕婦感染GBS的風險較高，臨床應重視圍生期孕婦GBS篩查，本研究樣本量有限，不同地區GBS的血清型、耐藥性均可能存在差異，實驗室應根據自身情況選擇最優的檢測方法。臨床應根據藥敏結果合理選用抗菌藥物，以提高治療的安全性和有效性，改善孕婦妊娠結局。