熒光定量PCR檢測巨細胞病毒DNA試劑盒的性能驗證及評價

朱舜華，李世寶,2△

1.徐州醫科大學醫學技術學院，江蘇徐州 221000；2.徐州醫科大學附屬醫院檢驗科，江蘇徐州 221000

巨細胞病毒(CMV)屬于皰疹病毒亞科,在宿主體內具有很強的潛伏能力[1]。根據宿主感染的時間可以分為先天性感染和獲得性感染[2]。先天性感染主要是孕婦通過垂直途徑感染新生兒[3]，會引起新生兒小頭畸形，腦室腫大，肝脾腫大等疾病[4]。成人感染CMV一般無癥狀，當機體免疫力低下時可導致肺孢子菌肺炎等并發癥[5]。目前臨床檢測抗體的靈敏度與特異度低，實時熒光定量PCR因其在檢測中快速、高效特點在臨床被廣泛應用[6]。根據CNAS-CL36醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明，實驗室開展新項目前需對所采用的商業檢測試劑進行方法學性能驗證，主要包括精密度、檢出限、正確度、線性范圍等[7]。因此，本研究對上海之江生物的CMV核酸(CMV-DNA)試劑盒進行性能驗證，以期達到臨床檢測的要求。

1 材料與方法

1.1標本來源 CMV-DNA標本來自2020年6月1日徐州醫科大學附屬醫院感染科。

1.2儀器與試劑 SLAN-96P熒光定量PCR儀。CMV-DNA測定試劑盒(批號P20191201)、CMV-DNA陰性血清對照品和CMV-DNA臨界陽性對照品均購自上海之江生物科技股份有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取與PCR反應 嚴格按照CMV-DNA測定試劑盒的要求進行。37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min循環一次；然后93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環40次，單點熒光檢測在60 ℃。PCR結果判讀：儀器生成準曲線后，會自動顯示定量值。當檢測樣本的檢測值在[(1.00E+03)～(1.00E+07)]copy/mL范圍時，測定結果有效。如果超過該范圍可將其稀釋后再進行測量。

1.3.2性能驗證指標及驗證方法

1.3.2.2檢出限 根據EP17-A文件的要求進行檢測線驗證時，至少測量20次。因此將已知結果的CMV陽性標本，稀釋至試劑檢測下限(1.00E+03)copy/mL附近，對該標本重復測量20次，進行結果分析,可接受標準：陽性檢出率>95%。

1.3.2.3正確度 取20例已知測定結果的樣本，其測定濃度值范圍為[0～(1.50E+07)]copy/mL，使其分布于整個線性范圍內。測定結果與標準品結果進行比較，繪制曲線。

1.3.2.4線性范圍 將7次方高濃度樣本進行10倍梯度稀釋達到或接近試劑盒標明的定量檢測限，進行2次重復檢測。然后以測量值為X，理論值為Y繪制擬合曲線，計算線性相關系數，R2≥0.980 0則符合要求。

2 結 果

2.1精密度 批內精密度驗證結果：高濃度樣本與低濃度樣本20次檢測結果其對數值的CV分別為1.64%、1.56%,見表1。批間精密度驗證結果：高濃度與低濃度樣本分別測定5次，每次重復4次其對數值的CV分別為1.64%、1.56%，見表2。批間與批內精密度CV值均小于規定標準5%，符合要求。

表1 CMV-DNA批內精密度評價結果

表2 CMV-DNA批間精密度評價結果

續表2 CMV-DNA批間精密度評價結果

2.2檢出限 已知試劑盒的最低檢出限為(1.00E+03)copy/mL，將樣本稀釋到檢出限，重復測定20次，其陽性檢出率為100%，超過行業標準規定的95%，符合要求，見表3。

表3 CMV-DNA檢出限的評價結果

2.3正確度 測定值與理論值的線性擬合方程為Y=0.984 1X+0.058 6，其R2為0.998 7符合要求，見圖1。

圖1 正確度線性結果

2.4線性范圍 將樣品濃度稀釋分布在試劑盒的線性范圍內，繪制線性擬合方程為Y=1.004 9X+0.018 2，R2=0.999 9，見圖2。

圖2 梯度稀釋線性結果

3 討 論

目前，我國是CMV感染的高發區，人均感染率為85%左右[8]。在人體免疫功能正常時CMV處于潛伏期,當人體免疫功能缺陷時，潛伏的病毒會大量增殖，所以，CMV感染是艾滋病患者的第二大機會性感染[9]。CMV感染也是常見的先天性感染，新生兒的免疫系統尚未發育完全，感染CMV之后會產生嚴重的后果，如聽力損傷、神經功能異常等[10]。因此，對CMV準確、快速地檢測顯得尤為重要。

實時熒光定量PCR對CMV檢出率高，克服了傳統PCR重復性差、易假陽性等缺點，在臨床得到了廣泛的應用[11]。實時熒光定量PCR通過檢測CMV-DNA載量來實現早期檢測，尤其是在CMV-IgM陰性時[12]。在進行實時熒光定量PCR結果分析時，需要將原始數據取對數再進行分析，因為實時熒光定量PCR原始數據成偏態分布，必須將其轉化為正態分布才能進行分析[13]。實驗室需對試劑進行獨立驗證，確保試劑盒在本實驗符合規定的要求。精密度評價實驗應放在其他實驗之前，因為精密度表示測量結果的再現性，是獲得良好準確性的先決條件[14]。本實驗結果顯示,高濃度與低濃度樣本批內與批間精密度的CV均小于5%，符合要求。

正確度為檢測結果均值與真值之間的一致程度，R2=0.998 7，說明測量值與理論值之間具有良好的一致程度，該試劑盒的正確度符合要求。將樣本稀釋在檢出限(1.00E+03)copy/mL附近，重復測量20次，檢出率為100%，這有利于提高臨床診斷的精準。線性范圍關系到是否可以為臨床提供可靠的信息，線性范圍越寬則就越適用于臨床[15]。本實驗所用試劑盒標明的線性范圍為[(1.00E+03)～(1.00E+07)]copy/mL，但是本實驗驗證所用的線性范圍為[(2.40E+03)～(2.26E+07)]copy/mL，最高濃度已經超過試劑盒所規定，線性良好R2=0.999 9，證明結果可靠。

綜上所述，本實驗的CMV-DNA試劑盒精密度高,正確度好,檢出限可靠,具有良好的線性范圍，可以滿足臨床的需要。