黑皮雞樅的分子鑒定與營養需求研究

羅影 關永強 賈培松 趙振豪 努爾孜亞?亞力買買提 魏鵬 賈文捷

摘要 為了明確黑皮雞樅的營養需求，促進其制種工藝的提高。以新疆麥蓋提縣人工栽培的菌株為試材，采用單因素試驗分別對其母種和原種的營養需求進行試驗。結果顯示，黑皮雞樅母種培養基中最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母浸粉，加入1%的MgSO4、CaCl2及棗粉均能促進其菌絲生長，而NaCl和KH2PO4抑制其菌絲生長，菌絲培養最適溫度為20～28? ℃，最適pH為5.5～6.0;原種培養基中將棉籽殼與木屑以7∶3比例混合作為主料使用效果明顯。

關鍵詞 黑皮雞樅;ITS;營養需求

中圖分類號 S 646? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）16-0044-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.013?? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study of Molecular Identification and Nutritional Requirement of ?Hymenopellis raphanipes

LUO Ying1，GUAN Yong-qiang2，JIA Pei-song1 et al （1.Institute of Plant Protection， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi，Xinjiang? 830091; 2.Xinjiang Institute of? Chinese Materia Medica and Ethnodrug，? Urumqi， Xinjiang? 830002 ）

Abstract To identify the effects of different nutrients on the mycelical growth of ?Hymenopellis raphanipes， ?and improve the level of strains production.The test was studied by single factor plate experiment， using a ?Hymenopellis raphanipes ?strain from Maigaiti County of Xinjiang as material.The results showed that the best carbon and nitrogen source were maltose and yeast extract respectively.The addition of 1% MgSO4， CaCl2 and jujube powder could promote the mycelial growth， while NaCl and KH2PO4 inhibited it.The optimal temperature range? was 20-28 ℃， and the optimal pH was 5.5-6.0.The mixture of cottonseed hull and sawdust at the ratio of 7∶3 was used as the main material.

Key words ?Hymenopellis raphanipes; ITS;Nutritional requirement

黑皮雞樅 （Hymenopellis raphanipes）， 又名二孢擬奧德蘑[1]、卵孢小奧德賽蘑、長根菇、長壽菇[2-3]，是新近商業化栽培的熱門食用菌。其在分類學上屬擔子門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Agaricales）、膨瑚菌（Physalacriaceae）[2]。該菌曾一度誤認為是長根小奧德賽蘑 （Oudemansiella radicata）、鱗柄小奧德賽蘑（Oudemansiella furfuracea）及雞樅菌（Termitomyces albuminosus） [4]。Hao等[4]基于ITS和LSU片段的分子系統學分析將該菌認定為 Oudemansiella raphanipes，分類學研究中把其劃歸為Hymenopellis 屬[5]。但由于我 國Oudemansiella raphanipes首次報道卵孢小奧德賽蘑時拉丁文名為Oudemansiella raphanipes， 所以為避免學名混亂，國內一部分研究一直使用該名[6]。

黑皮雞樅香味馥郁，肉質鮮嫩，含有豐富的氨基酸、蛋白質、多糖及礦物質元素等營養成分[7]，并具有較高的藥用價值，具有健脾益氣、止痛消腫等功效[3， 8]，是一種珍稀食藥用真菌。目前對于黑皮雞樅的研究，也涉及多個方面，包括子實體營養成分[7，9]、 化學成分及生物活性分析[8]，原生質體的制備[10]，液體培養基優化[3]及實際栽培中各項指標的研究[11-12]等。

我國黑皮雞樅的人工栽培史相對較短，2007年人工栽培成功[13]，后續又不斷對栽培技術進行優化，已實現規模化周年栽培[14]，目前山東、北京、四川、廣州、江蘇等地均有一定規模的人工栽培。隨著西部大開發和精準扶貧的開展，黑皮雞樅也在新疆有小規模的栽培，但栽培面積小、產量少、質量不穩定，產品遠遠不能滿足市場的需求。其中菌種是制約黑皮雞樅產業發展的因素之一。筆者對麥蓋提縣栽培的黑皮雞樅子實體進行組織分離，為防止出現同種異名的情況，對采集的黑皮雞樅進行ITS序列測定，明確種源，并對其母種和原種的營養需求進行研究，為黑皮雞樅的制種工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株。黑皮雞樅菌株（JZ004）保藏于新疆農業科學院植物保護研究所，其子實體采集于喀什地區麥蓋提縣人工栽培菇房。

1.1.2 培養基。PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然;基礎培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂20 g，pH自然;基礎代料配方：主料78%，麥麩20%，石膏1%，石灰1%。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的分離與純化。

采用組織分離法進行分離純化，選擇菇蓋肥厚、無病蟲害的子實體作為分離材料，先將采集的子實體用無菌水清洗表面，再用75%乙醇表面消毒，在菌蓋與菌柄交接處取0.3～0.4 cm3的組織，移放到PDA斜面培養基中央，置于25? ℃恒溫培養箱內培養，定期觀察菌絲生長情況，待菌絲長至1/2板時，挑取菌落邊緣新生菌絲轉接至PDA培養基平板，連續轉接3次即可得到純化菌株，純化好的菌株接種至PDA培養基斜面，待菌絲長滿斜面置于4 ℃保藏箱保藏，每個菌株保存5支。

1.2.2 菌種的活化與菌絲體收集。

將低溫保藏的黑皮雞樅菌種接種到PDA平板培養基上，25 ℃恒溫黑暗培養，待菌絲長滿平板備用。活化后，取菌絲尖端再接于PDA平板，培養基表面鋪一層玻璃紙。固體培養的菌絲體，用滅菌的接種鏟沿著玻璃紙的表面將菌絲體輕輕刮下，置稱量紙上，天平稱量備用。

1.2.3 ITS序列測定。

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）進行總DNA的提取，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量和濃度。

采用通用引物 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4 TCCTCCGCTTATTGGATATGC（由生工生物工程股份有限公司合成）進行PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）：2× Taq ?PCR MasterMix 12.5 μL，引物（10 μmol/L）各1.0 μL、模板1.0 μL，無菌雙蒸水補足至25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，72 ℃修復延伸10 min。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將PCR產物交于生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果提交至NCBI核酸數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/），進行BLAST比對分析。選取同源性較高的序列進行系統進化分析，利用MEGA 6.0軟件首先進行多重序列比對，再采用Neighbour-joining法構建系統發育樹，進行1 000次Bootstrap自舉法檢驗。

1.2.4 母種培養基優化

1.2.4.1 平板試驗法。每個平皿中央定量接種直徑5 mm的菌絲塊，25 ℃恒溫黑暗培養，主要以菌絲生長速度為指標，同時觀察菌落的形態特征、菌絲長勢等，所有試驗均采用90 mm的培養皿，培養基用量20 mL/皿。

1.2.4.2 培養基成分對黑皮雞樅菌絲生長的影響。

采用平板試驗法，分別固定基礎培養基上的碳源和氮源含量，對碳源、氮源及無機鹽進行單因素試驗，以基礎培養基為對照，恒溫暗培養，每個處理5個重復，綜合考慮菌絲長勢和菌絲生長速度，研究不同培養基成分對黑皮雞樅菌絲生長的影響。

1.2.4.3 培養條件對黑皮雞樅菌絲生長的影響。采用平板試驗法，使用PDA培養基，分別改變溫度（5～30 ℃）、pH（4.0～8.5）進行單因素試驗，每個處理5個重復，綜合考慮菌絲長勢和菌絲生長速度，研究不同培養條件對黑皮雞樅菌絲生長的影響。

1.2.5 原種培養基優化

1.2.5.1 平板篩選。

選擇食用菌栽培中常用的15種培養料，磨成粉末，過篩，在PDA培養基基礎上添加等量培養料，每個處理5個重復，篩選適合黑皮雞樅培養的培養料。

1.2.5.2 代料配方篩選。根據平板篩選結果，設計多個代料培養基配方，通過培養試驗，對比不同培養基配方下黑皮雞樅菌絲體生長速度和菌絲長勢等生物學指標，篩選出適宜代料培養基配方。

2 結果與分析

2.1? ITS序列 將測序結果在NCBI上進行BLAST可知，供試菌株與GenBank數據庫中卵孢小奧德賽蘑 （Hymenopellis raphanipes） 的ITS序列同源性大于99%。選取10個同源性較高的序列，以口蘑科口蘑屬松茸 ?（Tricholoma matsutake ?EU294302.1） 的ITS為外群，與JZ004一起，用MEGA7.0中Neighbor-joining 法（maximum likehood bootstrap trials=1 000），構建系統發育樹，結果見圖1。結果顯示，供試菌株種源明確，與 Hymenopellis raphanipes 聚為一簇，從分子水平上鑒定采集的樣本為卵孢小奧德賽蘑（ Hymenopellis raphanipes）。

2.2 母種培養基優化

2.2.1 培養基成分篩選

2.2.1.1 碳源。

由表1和圖2可知，黑皮雞樅在8種碳源培養基上均能生長，但在不同碳源培養基上，菌絲生長有較大差異。以單一無機碳源培養黑皮雞樅時，其菌絲長勢較差。以可溶性淀粉為碳源時，菌絲生長速度最快，但菌絲長勢較差，以麥芽糖為碳源時，菌絲生長速度達（5.81±0.84） mm/d，與對照和其他6種碳源存在顯著差異，且菌絲長勢最好，綜合菌絲長勢和生長速度，菌株JZ004 的最佳碳源為麥芽糖。

2.2.1.2 氮源。

由表2和圖3可知，黑皮雞樅在11種氮源培養基上均能生長，包括有機氮、氨基酸、無機氮化合物等，且不添加氮源時也能生長，但在不同氮源培養基上，菌絲生長有較大差異。其中以有機氮為氮源時菌絲相對濃密，菌絲長勢較好，且以酵母膏為氮源時，菌絲最為濃密粗壯，其次是酵母浸粉、牛肉膏、酸水解酪蛋白，以酵母浸粉為氮源時，生長速度最快，達（5.52±0.39）mm/d，牛肉膏和酸水解酪蛋白為氮源時次之。綜合菌絲長勢和生長速度，最佳氮源為酵母浸粉。

2.2.1.3 無機鹽。

由圖4可知，不同無機鹽對黑皮雞樅菌絲生長的影響效果有明顯差異。基礎培養基中加入MgSO4，在供試范圍內均能促進其菌絲生長，加入CaCl2，低濃度對黑皮雞樅菌絲生長起促進作用，后隨著濃度升高，又表現出抑制作用，且二者在加入量為1%，其促進作用均最明顯;而NaCl和KH2PO4在供試范圍內均起到抑制作用。

2.2.1.4 棗粉比例。

新疆當地紅棗資源豐富，以PDA培養基為基礎培養基，加入不同比例的棗粉，通過培養試驗，分析不同比例下黑皮雞樅菌絲體生長速度和菌絲長勢等生物學指標，篩選出適宜的母種培養基配方。結果顯示，菌株JZ004加入1%棗粉時，菌絲長速最快，且菌絲長勢較好（表3、圖5）。

2.2.2 培養條件篩選。

2.2.2.1 溫度。設計多個培養溫度，通過培養試驗，分析不同溫度下黑皮雞樅菌絲體生長速度和菌絲長勢等生物學指標，篩選出黑皮雞樅適宜生長的溫度。結果顯示，菌株JZ004在15～30 ℃均能生長，在5和35 ℃條件下，菌絲能萌發但不能吃料和生長。在20～28 ℃菌絲生長均較好，長速差異不顯著（表4、圖6）;結合圖3，黑皮雞樅為中高溫型菌株，菌絲在20～28 ℃均適合其生長。

2.2.2.2 pH。改變培養基pH，通過培養試驗，分析不同pH處理下黑皮雞樅的菌絲生長速度和菌絲長勢等生物學指標，篩選出黑皮雞樅適宜生長的pH。結果顯示，黑皮雞樅菌絲在pH為4.5～9均可生長，且改變培養基pH菌絲長勢差異不顯著。以菌絲長勢為評價指標，黑皮雞樅菌絲最適生長的pH在5.5～6.0，偏酸，差異顯著（表5）。

2.3 原種培養基篩選

2.3.1 平板篩選。

選擇食用菌栽培種常用的15種培養料，磨成粉末，過篩，在PDA培養基基礎上添加等量培養料，每個處理5個重復，篩選適合黑皮雞樅培養的培養料。結果顯示，PDA培養基中加入培養料粉末，菌株JZ004的菌絲密度和生長速度均有所增強，其中加入未發酵棉籽殼時，生長速度最快，差異顯著（表6、圖7）。

2.3.2 代料篩選。

根據平板篩選試驗，棉籽殼、木屑、玉米芯等均可以作為代料栽培黑皮雞樅。按照比例將棉籽殼和木屑混合作為主料，采用栽培袋進行試驗。結果見表7，主料為棉籽殼∶木屑7∶3比例混合時，菌株JZ004在栽培袋中生長速度最快，且菌絲濃白，因此，棉籽殼與木屑以7∶3比例混合可作為主料。

按照比例將以7∶3比例混合的棉籽殼與木屑，再與玉米芯進行混合，進行培養基主料篩選，結果見表8。主料加入玉米芯后，對黑皮雞樅生長速度影響差異不顯著，但總體上是不加入玉米芯的培養料中菌株JZ004菌絲生長相對較快。

3 結論與討論

黑皮雞樅作為一種營養價值豐富的食用菌，栽培前景廣闊，也是近年來比較熱門的商業化栽培食用菌。在新疆也有小規模的栽培，但存在產量少、質量不穩定、人工成本高等問題，產品遠遠不能滿足當地市場的需求。其中菌種是制約黑皮雞樅產業發展的因素之一。該研究以麥蓋提縣栽培的黑皮雞樅子實體進行組織分離的菌株為試材，對其進行ITS序列測定，以明確其種源，然后對其母種和原種的營養需求進行研究，以期為黑皮雞樅的制種工藝提供理論依據，為新疆黑皮雞樅的產業化發展提供技術支持。

該試驗結果表明，供試菌株種源明確， 與Hymenopellis raphanipes 聚為一簇，從分子水平上鑒定采集的樣本為卵孢小奧德賽 蘑（Hymenopellis raphanipes）。 綜合菌絲長勢和生長速度，黑皮雞樅菌絲生長的最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母浸粉，加入1%的MgSO4、CaCl2及棗粉均能促進其菌絲生長，而NaCl和KH2PO4抑制其菌絲生長，菌絲培養最適溫度為20～28 ℃，最適pH為5.5～6.0;原種培養基中棉籽殼、木屑、玉米芯等均可以作為代料栽培黑皮雞樅，其中將棉籽殼與木屑以7∶3比例混合作為主料使用效果最佳。

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