安徽省太和縣瓜類褪綠黃化病毒自然侵染南瓜的檢測分析

陳瑩 韓科雷 章東方 顧江濤 高正良 郭志 嚴丹侃 王芳

摘要 采集安徽省太和縣南瓜具有典型癥狀的病葉樣品進行RT-PCR檢測鑒定，并結合測序結果確定為CCYV。為了更加明確安徽太和地區CCYV的來源和序列的變異情況，測定了該病毒的外殼蛋白（coat protein，CP）序列進行系統發育分析，結果表明，此次安徽太和縣所檢測到的分離物與我國其他地區的分離物以及以色列、日本和希臘等國家存在較小的地域差異性，親緣關系較近，而與伊朗地區的分離物親緣關系相對較遠。該研究是安徽省CCYV侵染南瓜的首次報道，以期為該病害的預警和防控提供理論基礎和科學對策。

關鍵詞 南瓜;瓜類褪綠黃化病毒;系統發育分析

中圖分類號 S 436.42? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）16-0159-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.042?? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Detection and Analysis of Cucurbit? Chlorotic Yellow Virus Naturally Infecting Pumpkin in Taihe，Anhui Province

CHEN Ying， HAN Ke-lei， ZHANG Dong-fang et al

（Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract We collected samples of diseased leaves with typical symptoms for RT-PCR detection and identification， and combined the sequencing results to determine that it was CCYV. In order to more clarify the source and sequence variation of CCYV in Taihe， Anhui Province， the coat protein （CP） sequence of the virus was determined for phylogenetic analysis. The results showed that the isolates detected in Taihe， Anhui Province were relatively close to isolates from other areas of China， Israel， Japan， and Greece. The relationship with the isolates in Iran was relatively distant. This study was the first report of CCYV infestation of pumpkins in Anhui Province， in order to provide a theoretical basis and scientific countermeasures for the early warning and prevention of the disease.

Key words Pumpkin;Cucurbit chlorotic yellows virus;Phylogenetic analysis

瓜類褪綠黃化病毒（cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（ Crinivirus ），由2種類型的煙粉虱（B型和Q型）半持久性傳播[1-2]，不能夠通過摩擦接種傳播。CCYV在自然條件下可侵染多種瓜類作物，如西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜等[3-6]。CCYV最早是2004年日本學者在一個甜瓜的溫室大棚中發現，但其基因組序列是2010年才被鑒定出來[5]。我國2019年被首次報道（湖南省）CCYV在自然條件下侵染南瓜。雖然該病毒是毛形病毒屬近幾年新加入的成員，但其危害范圍較廣，蔓延速度較快，在伊朗[7]、黎巴嫩[8]、希臘[9]和蘇丹[10]等國家均有發生危害，此外在我國如上海[11]、臺灣[12]、山東[13]、新疆[4]、河南和海南[14]等地也均有報道。CCYV主要危害瓜類作物的葉片，癥狀表現為花葉、黃化和卷曲等，嚴重時導致整株壞死，顆粒無收[15]。

目前關于CCYV可以侵染南瓜的報道不多，調查發現在安徽太和縣溫室內發生在南瓜上的CCYV侵染十分嚴重，該病毒侵染南瓜后植株葉片表現出褪綠畸形，無法結出果實，嚴重影響了該地南瓜的產量和品質，造成大量的經濟損失。因此，為了明確安徽省太和縣CCYV侵染南瓜的發生情況和遺傳變異等問題，筆者利用RT-PCR的方法對其CP序列進行擴增檢測，并將本地的分離物與其他地區已報道的分離物進行系統發育分析，為安徽省太和縣CCYV發生情況和病害防控提供了數據支撐。這是繼我國湖南省報道的CCYV可以在自然條件下侵染南瓜后的第二次報道，同時這是安徽省CCYV可以在自然條件下侵染南瓜的首次報道。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年10月，在安徽省太和縣舊縣鎮精準扶貧就業基地的南瓜溫室中，南瓜表現出大面積的葉片褪綠、黃化、壞死及植株矮化等癥狀，造成整個溫室的南瓜顆粒無收，采集具有典型病毒病癥狀的帶毒樣品，對其樣品進行編號后置于液氮中速凍，并保存于-80 ℃超低溫冰箱，待進行后續實驗室內檢測鑒定。

1.2 檢測方法

1.2.1 RT-PCR 檢測。

根據該基地溫室中南瓜葉片的發病癥狀以及溫室大棚中出現煙粉虱等傳毒介體，推測其可能受CCYV的侵染，因此根據NCBI中所報道的CCYV CP序列設計特異性引物，進行RT-PCR檢測。將采集的帶毒樣品進行充分研磨后，參照TIANGEN植物總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit進行植物總RNA提取，然后根據Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ說明書操作（購于艾科瑞生物有限公司），對所提取的RNA樣品進行反轉錄。以反轉錄合成的cDNA為模板，利用2×Mix（購于北京艾德萊生物有限公司）進行RT-PCR擴增檢測。上游引物CCYV-CP-F：5′-CGTAAGTGATCGCAATCAAT-3′;下游引物CCYV-CP-R：5′-AGTGATCACTTGACCATCTCC-3′。擴增片段長度為876 bp。反應條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃ 10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送至南京生工生物技術有限公司測序，測序結果通過BLAST進行比對。

1.2.2 系統發育分析。

采用MEGA 7.0軟件進行系統發育分析，使用鄰接法（neighbor-joining）建樹，Bootstrap replications中輸入1 000，序列比對時選擇氨基酸（amino acid），由此完成建樹[16]。

2 結果與分析

2.1 CCYV發生情況

對安徽省太和縣舊縣鎮精準扶貧就業基地的南瓜溫室進行了調查分析。溫室內南瓜產區病毒病發生十分嚴重，并出現煙粉虱等傳毒介體，受病毒病侵染的南瓜葉片表現為褪綠黃化、皺縮、畸形、壞死，且植株矮化，不結果實。典型癥狀見圖1。

2.2 CCYV的RT-PCR檢測鑒定

將采集的4組表現病毒病癥狀的樣品進行病毒檢測，根據合成的CCYV特異性引物進行RT-PCR驗證，檢測結果發現，采集的4組樣品中，有一組樣品檢測出相應條帶，條帶大小為876 bp（圖2）。PCR產物通過測序后，確定為瓜類褪綠黃化病毒。通過Blast比對后，CCYV CP 序列全長753 bp，編碼250個氨基酸，且發現該次檢測到的CCYV CP序列與登錄號為KY400633.1、KX118632.1、LT716000.1、JQ904629.1、MH819191.1和JN126046.1的CP序列完全一致。該分離物CP核苷酸序列與其他地區已報道的分離物核苷酸序列同源性在94.82%～99.87%，這是安徽省CCYV自然侵染南瓜的首次報道，后續對于該基地南瓜的發病情況也會持續調查和研究。

2.3 CCYV的CP序列系統發育分析

為明確安徽省太和南瓜CCYV的分類地位以及與各地區所報道的同種病毒不同寄主之間的親緣進化關系，將檢測到的CCYV CP序列結合已報道的29個 CCYV CP序列進行系統發育分析，并將bean yellow disorder virus分離物（登錄號：EU191905.1）作為外群一起構建系統發育樹（圖3）。結果發現，CCYV的不同分離物在不同地區具有一定的地理特征。中國各地區的分離物與日本、塞浦路斯、以色列和希臘地區的分離物差異較小，親緣關系較近，而與伊朗地區的分離物親緣關系較遠，分別屬于2個不同的分支。此外有些CCYV分離物雖然來源于同一地區，但由于發生的寄主植物不同，在分類地位上也存在一定的差異，如山東省在西瓜和絲瓜上所報道的CCYV分離物處于不同的分支。

3 結論與討論

瓜類褪綠黃化病毒作為長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（ Crinivirus ）的新成員，近幾年對瓜類等葫蘆科作物造成較嚴重的侵害和損失[15]。自2010年CCYV被日本首次報道[5]，同年在我國臺灣地區也檢測到該病毒[12]，隨后在2011年我國山東省、浙江省和上海市的西瓜、甜瓜和黃瓜上均檢測到CCYV，且病害發生率在50%～100%[17-18]，給農業生產造成了嚴重損失。該研究通過RT-PCR檢測，確定安徽省太和縣南瓜上暴發的病毒為CCYV，這是安徽省CCYV侵染南瓜的首次報道。通過對CCYV CP序列與其他地區的分離物同源性進行比對分析，結果表明此次檢測到的CCYV分離物與已報道的6個其他分離物核苷酸同源性為100%，登錄號分別為KY400633.1、KX118632.1、LT716000.1、JQ904629.1、MH819191.1和JN126046.1。核苷酸序列與伊朗地區的分離物同源性較差，為94.82%～95.09%，與其他地區已報道的分離物核苷酸同源性為97.79%～99.87%。構建系統進化樹發現，該地區所檢測的分離物與我國其他地區的分離物親緣關系密切，與伊朗地區分離物親緣關系較遠。太和縣舊縣鎮精準扶貧就業基地作為安徽省重要的農產品扶貧產業區，南瓜生產遭受CCYV危害十分嚴重，主要表現為南瓜葉片褪綠黃化皺縮畸形，影響果實生長，造成嚴重的經濟損失。2014年蘇丹地區報道了CCYV能夠自然侵染南瓜[19]，但在2019年湖南省首次發現并報道了CCYV能夠自然侵染南瓜[6]。因此，結合近幾年各地CCYV的發生蔓延情況和基于該次調查的結果，應引起CCYV對南瓜生產方面的重視，積極有效地采用防治措施加以防治。同時安徽CCYV與已報道的CCYV基因組核苷酸和氨基酸序列變異較小，表明未來在抗性品種的選育方面可能較容易找到適合各地的抗病性設計靶標，該試驗結果旨在為CCYV的防控和抗性育種等方面提供理論參考。

參考文獻

[1] 古勤生，彭斌，劉珊珊，等.瓜類新病毒病害（一）：瓜類褪綠黃化病[J].中國瓜菜，2011，24（3）：32-33.

[2] LI J J，LIANG X Z，WANG X L，et al.Direct evidence for the semipersistent transmission of ?Cucurbit chlorotic yellows virus ?by a whitefly vector[J].Scientific reports，2016，6：1-8.

[3] WINTERMANTEL W M，JENKINS HLADKY L L，FASHING P，et al.First report of ?Cucurbit chlorotic yellows virus ?infecting melon in the new world[J].Plant disease，2019，103（4）：778.

[4] 潘衛萍，張以和，吉艷玲.吐魯番首次發生甜瓜褪綠黃化病毒病[J].蔬菜，2017（2）：60-61.

[5]

OKUDA M，OKAZAKI S，YAMASAKI S，et al.Host range and complete genome sequence of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus，a new member of the genus ?Crinivirus [J].Phytopathology，2010，100（6）：560-566.

[6] 劉放，劉勇，張德詠，等.瓜類褪綠黃化病毒自然侵染南瓜及分子進化分析[J].植物病理學報，2021，51（1）：1-10.

[7] BANANEJ K，MENZEL W，KIANFAR N，et al.First report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus infecting cucumber，melon，and squash in Iran[J].Plant disease，2013，97（7）：1005.

[8] ABRAHAMIAN P E，SOBH H，ABOU-JAWDAH Y.First report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus on cucumber in Lebanon[J].Plant disease，2012，96（11）：1704.

[9] ORFANIDOU C，MALIOGKA V I，KATIS N I.First report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus in cucumber，melon，and watermelon in Greece[J].Plant disease，2014，98（10）：1446-1447.

[10] HAMED K， MENZEL W， DAFALLA G，et al.First report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus infecting muskmelon and cucumber in Sudan[J].Plant disease，2011，95（10）：1321.

[11] 曾蓉，徐麗慧，顧海峰，等.瓜類黃化褪綠病毒上海分離物外殼蛋白的原核表達及其抗血清的制備[J].中國農學通報，2014，30（22）：276-281.

[12] HUANG L H，TSENG H H，LI J T，et al.First Report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus infecting cucurbits in Taiwan[J].Plant disease，2010，94（9）：1168.

[13] 臧連毅，孫曉輝，蘇文敏，等.瓜類褪綠黃化病毒山東分離物全基因組序列擴增及分析[J].植物保護學報，2019，46（6）：1195-1202.

[14] 劉珊珊，彭斌，吳會杰，等.海南省和河南省發生甜瓜褪綠黃化病的分子鑒定[J].果樹學報，2013，30（2）：291-293.

[15] ABRAHAMIAN P，SOBH H，SEBLANI R，et al.Co-infection of two criniviruses and a begomovirus enhances the disease severity in cucumber[J].European journal of plant pathology，2015，142（3）：521-530.

[16] KUMAR S，STECHER G，TAMURA K.MEGA7：Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 bigger datasets[J].Molecular biology and evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[17] ZENG R，DAI F M，CHEN W J，et al.First Report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus infecting melon in China[J].Plant disease，2011，95（3）：354.

[18] GU Q S，LIU Y H，WANG Y H，et al.First report of ?Cucurbit chlorotic ?yellows virus in cucumber，melon，and watermelon in China[J].Plant disease，2011，95（1）：73.

[19] MOHAMMED H S，ZICCA S，MANGLLI A，et al.Identification and phylogenetic analysis of common pumpkin viruses in Sudan[J].Journal of plant pathology，2014，96（1）：77-84.