不同保存條件下羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解規律研究

周玲 李秋月 雷從改 符芳霞 李云 程斌 覃銳 劉天密

摘要 選擇經常檢出的磺胺嘧啶作為研究對象，通過測定不同保存條件下羅非魚中不同濃度磺胺嘧啶的穩定性，確定羅非魚磺胺類藥物監測中的樣品保存條件和運輸溫度條件。結果表明，樣品中不同濃度的磺胺嘧啶均有不同程度的降解，但因保存條件的不同，降解速率各不相同。在常溫條件下保存，羅非魚樣品中磺胺嘧啶的濃度越高，降解速度越慢;在冷藏條件下保存，羅非魚樣品中磺胺嘧啶濃度越高，也呈降解速度越慢的趨勢;在冷凍條件下保存，羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度沒有明顯的變化。羅非魚樣品中不同濃度的磺胺嘧啶在3種保存條件下（常溫25～28 ℃，冷藏0～4 ℃，冷凍-18～-22 ℃）的降解速率為常溫>冷藏>冷凍。因此，用于磺胺嘧啶檢測的羅非魚樣品應貯存于冷凍條件下，并盡快分析。

關鍵詞 羅非魚樣品;磺胺嘧啶;降解規律

中圖分類號 S 948? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）16-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.047?? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Degradation of Sulfadiazine under Different Storage Conditions in Tilapia Fish Muscle Samples

ZHOU Ling，LI Qiu-yue，LEI Cong-gai et al

（Testing Center for Aquatic Products Quality and Safety of Hainan Province，Haikou， Hainan 570206）

Abstract The frequently detected sulfadiazine was selected as the research object. To ensure the transportation temperature and storage conditions of tilapia fish muscle samples for monitoring of sulfonamides by detecting the stability of different concentrations of sulfadiazine in tilapia fish muscle samsulfonamidesples under different storage conditions. The results showed that sulfadiazine of different concentrations in tilapia fish muscle samples degraded with various degrees， however， the degradation rate varied due to different storage conditions. The degradation rate of sulfadiazine in tilapia fish muscle samples were both slower with the increase of sulfadiazine concentration at room temperature and cold storage. But there was no significant change in the degradation rate of sulfadiazine in tilapia fish muscle samples stored under freezing condition. The result also showed that the degradation rate of sulfadiazine at different concentrations in tilapia fish muscle samples under three storage conditions were in order of room temperature condition > refrigerated condition > freezing condition. Therefore， tilapia fish muscle samples for sulfadiazine detection should be stored under freezing conditions and analyzed as soon as possible.

Key words Tilapia fish muscle samples;Sulfadiazine;Degradation law

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥，它具有抗菌譜較廣、性質穩定、使用簡便等優點，在水產養殖中廣泛使用[1]。但是，如果磺胺類藥物使用不當或使用時未遵守其休藥期，可造成藥物在動物組織中的殘留[2-3]。殘留的藥物不僅會對人的健康造成潛在危害，引起過敏反應、腎臟損壞、白細胞減少癥等，還是水產品出口貿易中的主要障礙[4]。2015年美國FDA發布拒絕進口產品通報，其中我國廣西、海南等地多批羅非魚因獸殘問題被拒絕入境。因為磺胺問題，給我國的羅非魚養殖業帶來了嚴重影響，造成養殖企業和養殖戶的巨大經濟損失。

美國、歐盟、日本等已禁止磺胺類藥物用于水產養殖業。羅非魚磺胺類藥物殘留監測迫在眉睫。以往的研究多集中于活體動物藥代動力學和檢測方法方面[5-10]，而不同保存條件對羅非魚中磺胺類藥物檢測結果的影響鮮見報道。該研究選擇經常檢出的磺胺嘧啶作為研究對象，擬通過測定不同保存條件下羅非魚中不同濃度磺胺嘧啶的穩定性，以確定羅非魚磺胺類藥物監測中樣品的保存條件和運輸溫度條件。

1 材料與方法

1.1 試驗對象和藥物

通過走訪、調查和2015—2017年的專項抽檢發現，磺胺類藥物中磺胺嘧啶最易超標。由于磺胺嘧啶是限用藥，選用上市規格的羅非魚作為研究對象，羅非魚500 g/尾左右。試驗羅非魚購自海南振宇實業有限公司，并租用該公司7個養殖網箱進行養殖試驗，設有增氧設備。每個養殖網箱投放20尾羅非魚，試驗羅非魚暫養10 d后開始投喂拌藥飼料。

試驗用磺胺嘧啶為標準試劑（≥98.0%），采用拌料投喂的方式進行給藥。

1.2 試驗設計

設置4、8、12 mg/kg 3個不同給藥濃度，每個濃度2個平行，6個試驗組，1個空白對照組（CK），共7個組。除了藥物濃度不同，其他養殖條件保持一致。給藥前7 d在實驗室將不同藥物濃度的飼料拌好晾干分裝并存放于冰柜中。6月19日開始分別在6個試驗網箱中投喂相應濃度的拌藥飼料。給藥7 d后，隨機抽取10尾羅非魚，取其肌肉制成肉糜在不同條件下保存[常溫（25～28 ℃）、冷藏（0～4 ℃）和冷凍（-18～-22 ℃）]。

常溫保存下易變質，樣品于保存的第0、1、2、3、6天取出，檢測其磺胺嘧啶含量，冷藏樣品于保存的第0、1、2、3、6、10、20天取出，冷凍樣品于保存的第0、1、2、3、6、10、20、30、41天取出，在常溫下解凍后檢測磺胺嘧啶含量。

7個養殖網箱中剩下的羅非魚繼續養殖22 d后（按500度日的休藥期進行計算，池溫25～28 ℃），捕獲帶回實驗室，分別去磷、去皮，取其肌肉均質制成肉糜，檢測其磺胺嘧啶的含量。

1.3 樣品處理

喂藥后7 d，分別捕獲7個養殖網箱的羅非魚，帶回實驗室去磷、去皮，取其肌肉均質制成肉糜。按試驗設計要求，每組羅非魚肉糜平均分成21份（常溫5份，冷藏7份，冷凍9份），分別保存于不同環境條件下。

1.4 主要儀器與試劑

試驗儀器：AB SCIEX Triple QuadTM 4500三重四級桿液質聯用儀，渦旋混合器（英國Stuart SA8），超聲波清洗儀（德國Elma S 300H），低速冷凍離心機（上海安亭DL-6000B），旋轉蒸發儀（英國Stuart RE300DB）。

試驗用水為Milli-Q制備高純水;甲醇、乙腈均為色譜純，購自Merk公司;甲酸為色譜純，購自上海科密歐公司;乙酸銨為色譜純，購自阿拉丁公司;磺胺嘧啶標準品，購自北京壇墨公司;磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3標準品，購自農業部農產品質量標準研究中心。

1.5 樣品檢測

試驗方法參照《水產品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法 農業部1077號公告-1-2008》《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法 GB/T 21316—2007》及相關文獻進行。0 d的回收率99%，2 d的回收率83%。

2 結果與分析

2.1 羅非魚樣品保存0 d磺胺嘧啶檢測結果對比

該試驗采取低、中、高3種濃度磺胺嘧啶拌料投喂各試驗組羅非魚，以獲得自然的帶有磺胺嘧啶的羅非魚樣品。由表1可知，除了6# 網箱外，各試驗網箱中羅非魚磺胺殘留量的測定值與投喂濃度之間呈正相關，這可能與6#網箱中羅非魚的進食量不佳有關。各測定值之間存在顯著差異（ P <0.05），即使是相同的投喂濃度，4、8和12 mg/kg組間也存在顯著差異，這可能是由于自然投喂給藥條件下羅非魚的進食量不同所致。試驗組間各測定值的變異系數最小為0.04，最大為0.13，平均值為0.08，這說明在對羅非魚樣品進行制樣處理時，攪拌相對比較均勻。而CK的測定值之間差異大，有可能是檢測誤差造成。

2.2 羅非魚樣品中磺胺嘧啶在常溫狀態下的降解規律

在常溫下，羅非魚樣品放置2 d開始產生異味，放置6 d后，已經完全腐敗，分別檢測保存0、1、2、3、6 d后其磺胺嘧啶含量，檢測結果見表2。由表2可知，在常溫條件下保存，各試驗組羅非魚樣品中磺胺嘧啶含量基本都隨保存時間的延長呈現不斷下降的趨勢。6 d后，1#羅非魚磺胺嘧啶降解了100%，2#? 降解了86.13%，3# 降解了43.20%，4# 降解了53.87%，5# 降解了34.01%，6# 降解了7540%。這說明在常溫條件下保存，羅非魚中的磺胺嘧啶較易降解。

2.3 羅非魚樣品中磺胺嘧啶在冷藏狀態下的降解規律

冷藏條件下保存的羅非魚樣品在保存10 d時出現異味，20 d已經腐敗。分別檢測其保存0、1、2、3、6、10、20 d后磺胺嘧啶含量，檢測結果見表3。由表3可知，在冷藏條件下保存，各試驗組羅非魚中磺胺嘧啶含量均隨保存時間的延長呈不斷下降的趨勢。保存6 d后，1#羅非魚磺胺嘧啶降解了1819%，遠小于常溫組的100%;2# 降解了1443%，遠小于常溫組的86.13%;3# 降解了12.68%，遠小于常溫組的43.20%;4# 降解了14.95%，遠小于常溫組的53.87%;5# 降解了4.36%，遠小于常溫組的34.01%;6# 降解了18.94%，遠小于常溫組的75.40%。20 d后，1# 羅非魚磺胺嘧啶降解了19.56%，2# 降解了17.95%，3# 降解了22.87%，4# 降解了1698%，5# 降解了11.11%，6# 降解了30.88%，均低于常溫下保存6 d的降解百分比。這說明相較于常溫條件下保存，羅非魚樣品中的磺胺嘧啶在冷藏條件下保存的降解速度要慢得多。

2.4 羅非魚樣品中磺胺嘧啶在冷凍狀態下的降解規律

在冷凍條件下保存41 d，羅非魚樣品未出現異味，分別檢測其保存0、1、2、3、6、10、20、30、41 d后磺胺嘧啶的含量，檢測結果見表4。由表4可知，在冷凍條件下保存6 d后，1#、2#、3#、4#、5#和6#組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解百分比分別為11.01%、16.88%、10.60%、5.86%、5.79%和6.79%，遠小于常溫下保存6 d各組的降解百分比，1#、3#、4#和6# 組小于冷藏保存6 d各組的降解百分比，2#和5#組無明顯差異;在冷凍條件下保存10 d后，1#、2#、3#、4#、5#和6# 組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解百分比分別為5.12%、8.97%、4.13%、946%、6.93%和4.54%，出現了不降反升的現象。在冷凍條件下保存20 d后，各組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解百分比分別為16.75%、20.48%、17.43%、2035%、18.26%和25.61%，與冷藏保存20 d各組的降解百分比沒有明顯差異;在冷凍條件下保存41 d，各組羅非魚樣品的磺胺嘧啶含量均呈下降趨勢。

2.5 休藥后的檢測結果

7個養殖網箱中剩下的羅非魚繼續養殖22 d（過休藥期）后，由于部分羅非魚死亡，只有1#、2#、3#、4#和6# 網箱中還有羅非魚存活，分別取其肌肉制成肉糜，經檢測，1#、2#、3#、4#和6# 網箱羅非魚樣品磺胺嘧啶的測定值分別為14.31、19.58、10.35、26.52和11.24 μg/kg，遠小于國定規定的限量值100 μg/kg。這說明在羅非魚養殖過程中使用磺胺嘧啶后，只要嚴格執行休藥期的規定，磺胺嘧啶含量基本均能降解到安全范圍內。

3 討論

3.1 該試驗的創新與不足

與以往采用加標獲得試驗用陽性樣品的方式不同，該試驗采用與養殖生產實際一致的拌料投喂的給藥方式。雖然低濃度、中濃度和高濃度組間羅非魚樣品中最終磺胺嘧啶含量的平行性不佳，但也獲得了具有顯著差異（ P <0.05）的梯度磺胺嘧啶羅非魚樣品。通過拌料投喂的給藥方式，保持了與養殖生產實際的一致性和陽性樣品的真實性，研究結果更利于實際的檢測應用。該試驗不足之處有3點：不同給藥濃度組間平行不夠，至少設置3個平行，而該試驗只設置了2個平行;每次檢測至少進3針，求3次檢測結果的平均值，而該試驗檢測時只進1針，檢測結果的代表性不足;冷凍樣品的解凍時間未嚴格保持一致，導致冷凍保存10 d的檢測結果出現異常。在今后試驗研究中要做好前期準備和試驗設計，減少此類因素對試驗結果造成的影響。

3.2 樣品中藥物濃度對降解速率的影響

常溫條件下，保存6天后各試驗組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度為1#（100%）>2#（86.13%）>6#（75.4%）>4#（53.87%）>3#（43.2%）>5#（34.01%），濃度越高降解速度越慢;冷藏條件下，保存20 d后各試驗組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度為6#（30.88%）>3#（22.87%）>1#（19.56%）>2#（17.95%）>4#（16.98%）>5#（11.11%），基本也呈濃度越高降解速度越慢的趨勢。冷凍條件下，保存41 d后各試驗組羅非魚樣品中磺胺嘧啶的降解速度為4#（52.20%）>6#（43.64%）>2#（36.21）>3#（32.49%）>5#（32.13%）>1#（30.07%），沒有明顯的變化趨勢。

3.3 樣品保存條件對檢測結果的影響

為了保證樣品中待測成分的穩定性，樣品必須儲藏在一定的溫度條件下，對保存時間也有嚴格的要求。李長皓等[11]研究表明，不同保存條件會影響生鮮乳質量安全指標的檢測結果，樣品冷藏時間在48 h以內、冷凍時間在30 d以內，均對樣品中黃曲霉毒素、鉛、汞、砷、鉻、三聚氰胺的檢測結果無影響。

當保存條件和保存時間不當時，就會影響樣品中成分的穩定性。該試驗的研究結果表明，羅非魚樣品中不同濃度的磺胺嘧啶在3種保存條件下（常溫25～28 ℃，冷藏0～4 ℃，冷凍-18～-22 ℃）的降解速率為常溫>冷藏>冷凍。黃向榮等[12]研究結果表明，不同濃度的孔雀石綠和隱性孔雀石綠在3種貯藏條件下（室溫20～25 ℃，冷藏0～4 ℃和冷凍-18 ℃）均有不同程度的降解，但因貯藏條件的不同，降解速率各不相同，降解速率為常溫>冷藏>冷凍。如果樣品能盡快進行檢測，即可在常溫和冷藏條件下進行短期保存;如樣品不能盡快安排檢測，則須冷凍保存，但冷凍保存時間也不易過長。趙慧星等[13]研究了蔬菜中殘留農藥在不同溫度條件下的降解速率，結果表明，常溫條件下各農藥的降解速率較快，低溫冷藏條件下，各農藥降解速度均有所下降，但不同農藥在同一溫度條件下的降解速率也不相同。有些藥殘樣品需在冷藏和冷凍條件下保存，但另一些藥殘樣品則需在常溫和冷凍條件下保存。不同貯藏條件下加標樣品中的五氯酚鈉均有所降解，降解速率表現為冷藏條件> 常溫條件>冷凍條件[14]。五氯酚鈉加標樣品可以在常溫下進行短時間保存，便于盡快進行檢測;但如樣品不能盡快安排檢測（超過24 h），則需用冷凍保存，以保存樣品的原有屬性，避免影響檢測結果。

參考文獻

[1] 陳杖榴.獸醫藥理學[M].3版.北京：中國農業出版社，2009：266-270.

[2] 方鉦.磺胺對甲氧嘧啶膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制[D].揚州：揚州大學，2010.

[3] 劉緋，李清.選用抗菌抗生素類漁藥的注意事項[J].中國水產，2008（11）：69.

[4] 蔣德陽，田淑琴，黃雅杰.動物性藥物殘留對人體的危害及控制措施[J].四川畜牧獸醫，2003，30（8）：31-32.

[5] 艾曉輝，劉長征，周運濤.不同水溫和給藥方式下磺胺甲噁唑在草魚體內的藥動學研究[J].水生生物學報，2005，29（2）：210-214.

[6] 袁科平，艾曉輝.磺胺甲噁唑在羅非魚體內的藥代動力學及組織濃度研究[J].水利漁業，2008，28（3）：25-27.

[7] 孫玉增，劉慧慧，秦華偉，等.磺胺甲基異噁唑在大菱鲆體內的代謝動力學研究[J].漁業科學進展，2009，30（6）：42-47.

[8] 任利強，王茂劍，宮向紅，等.磺胺甲噁唑在黑鲪肌肉中藥代動力學及殘留研究[J].海洋湖沼通報，2009（4）：123-126.

[9] 范能全.磺胺二甲嘧啶在鯽魚體內的藥代動力學研究[J].重慶師范大學學報（自然科學版），2010，27（3）：23-26.

[10] 肖賀，王偉利，姜蘭，等.不同溫度下復方磺胺嘧啶在羅非魚體內的藥代動力學[J].華南農業大學學報，2014，35（6）：13-18.

[11] 李長皓，喬綠，鄭楠，等.不同保存條件和處理方法對生鮮乳質量安全指標檢測結果的影響[J].中國奶牛，2015（22）：52-57.

[12] 黃向榮，萬譯文，李小玲，等.不同儲藏條件下鱖魚樣品中孔雀石綠及隱色孔雀石綠的降解規律研究[J].湖南農業科學，2014（9）：69-74.

[13] 趙慧星，趙科華，車軍，等.實驗室條件下幾種常見農藥降解規律研究[J].安徽農業科學，2009，37（6）：2694-2695.

[14] 穆迎春，惠蕓華，馬兵，等.不同貯藏條件下草魚五氯酚鈉加標樣品降解研究[J].中國漁業質量與標準，2012，2（2）：63-69.