高鹽環境對大鼠冠狀動脈平滑肌鈣庫操縱的鈣內流及其介導的收縮功能的影響

何 可，肖 慧，盧昊陽，代曼玉，沈 兵，趙 韌

膳食鈉攝入量增高，冠狀動脈痙攣和缺血性心臟病的風險增加，這與冠脈血管反應性的變化有關。研究證實，高鹽飲食使血管床對激動劑的反應性增強。鹽敏感性高血壓會引起細胞外液中的鈉水潴留，神經體液因素通過冠脈內受體機制影響血管張力。有研究發現血栓素及內皮素受體下游IP受體-SOCE途經關鍵性調節了小動脈血管張力。鈣庫操縱的鈣內流(store-operated Caentry，SOCE)保持內質網Ca的穩態，是維持血管平滑肌(vascular smooth muscle cells，VSMCs)收縮功能的重要環節。雖然高鹽飲食可能導致血管反應性及細胞外Na濃度的暫時性增加，但其是否改變SOCE介導的冠脈收縮及其Ca內流機制尚不清楚。該研究旨在討論細胞外高鹽環境對冠狀動脈收縮功能的影響，為高血壓相關缺血性心臟病臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

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動物 本研究中所用大鼠均嚴格遵守《中華人民共和國實驗動物管理條例》，并已得到安徽醫科大學動物倫理委員會的允許。實驗用動物為體質量300 g左右清潔級雄性SD大鼠。所有實驗大鼠均于25℃左右通風環境下自由活動、飲食。

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試劑與儀器 Orai1、ET抗體購自美國Affinity Biosciences公司；STIM1抗體購自美國GeneTex公司；U46619購自美國Sigma公司；ET-1購自美國MedChemExpress公司； Pluronic F-127購自美國Invitrogen公司；微血管張力檢測儀(DMT620M)購自丹麥 Danish Myo Technology A/S 公司；體式輔助顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社；熒光顯微鏡(Nikon T200)購自日本尼康公司。Krebs液(mmol/L) NaCl 118、KCl 4.7、CaCl2.5、KHPO1.2、MgSO·7HO 1.2、NaHCO25.2、CHO11.1；高鉀溶液(mmol/L) NaCl 58、KCL 60、CaCl2.5、KHPO1.2、MgSO·7HO 1.2、NaHCO25.2、CHO11.1；1 mol/L NaCl溶液。

1.2 方法

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冠狀動脈環的制備 大鼠用CO窒息處死后，手術剪打開胸腔，取出心臟后置于滅菌 PBS 液中輕輕擠壓排出血液，在顯微鏡下仔細剝出冠狀動脈，分離周圍肌肉組織，注意不要鉗夾及牽拉血管。分離出的冠狀動脈剪成4段1.8～2.0 mm長的血管環，用細金屬絲去除血管內皮。整個分離過程要在4℃冰浴且不斷通有95% O和5% CO混合氣體的條件下進行。

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離體血管培養 用無菌PBS將游離的冠狀動脈血管環洗3次后放入含10%胎牛血清的1640培養基中，分別加入10、20、30、40 μl的1 mol/L NaCl溶液，放進培養箱培養24 h后進行離體血管張力實驗。

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離體血管張力實驗 在DMT張力儀的浴槽中預置5 ml Krebs液并通有95% O和5% CO混合氣體，維持溫度在37 ℃，將培養的冠狀動脈血管環用細鋼絲固定于浴槽中。調節張力換能器給血管施加2 mN的基礎張力，利用 Powerlab 生物信號記錄系統記錄血管張力的變化。待血管在Krebs液平衡1 h且張力穩定后，用60 mmol/L高鉀溶液激動血管2次，待達到最大收縮效應時，用Krebs液沖洗3次至基礎張力，每次間隔5 min。為檢測血管內皮活性，用1 μmol/L的U46619刺激血管收縮，維持5 min后用1 μmol/L Ach誘導血管舒張，若舒張幅度小于20%，則說明內皮去除良好，方可進行后續實驗。洗脫4次至基線張力后，依次用U46619(0.01～3 μmol/L)、ET-1(1～300 nmol/L)誘導血管進行濃度依賴性收縮，觀察并測定其張力變化。在SOCE誘導的收縮實驗中，首先用不含CaCl的Krebs液沖洗3次以清除細胞外Ca，每次間隔5 min，然后加入1 μmol/L維拉帕米和100 nmol/L ET-1孵育10 min以耗盡內質網中存儲的Ca，記錄CaCl(1～10 mmol/L)誘導的血管濃度依賴性收縮。

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鈣成像實驗 大鼠冠脈平滑肌細胞株(rat coronary arterial smooth muscle cells，RCASMCs)傳代種板于30 mm玻璃蓋玻片上。分別用含137.65 mmol/L和157.65 mmol/L NaCl的完全培養基培養24 h后進行細胞鈣成像實驗。用含6 μmol/L Fluo-8 AM和0.02% Pluronic F-127的培養基孵育細胞30 min，隨后在不含Ca的OPSS緩沖溶液中用4 μmol/L毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)處理10 min以耗竭內質網中Ca存儲，隨即添加2 mmol/L CaCl誘導細胞外Ca內流。在熒光顯微鏡下檢測和記錄熒光，Fluo-8的激發和發射波長分別為488和515 nm。將添加細胞外Ca之后與添加之前的熒光強度之比(F/F)作為[Ca]i變化量。

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免疫組織化學實驗 大鼠離體冠狀動脈用不同濃度高鹽培養基(分別含137.65～167.65 mmol/L NaCl)培養24 h后，取出并固定于4% 多聚甲醛中。脫水并包埋成組織蠟塊后切成5 μm厚的切片。經脫蠟、水化、修復抗原后用0.3%過氧化氫處理以封閉內源性過氧化物酶，室溫下用10%山羊血清封閉30 min。隨后加一抗，在4℃下孵育過夜。室溫復溫30 min后用PBS沖洗，室溫下用二抗孵育30 min，經 DAB 顯色后用蘇木精對切片進行復染，流水沖洗后用顯微鏡觀察是否染色完全，烘干后用中性樹脂封片晾干，鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 高鹽培養對U46619和ET-1誘導的冠狀動脈血管收縮的影響

采用累積給藥法加入U46619 (0.01～3 mmol/L)或ET-1(1～300 nmol/L)，可誘導大鼠冠狀動脈產生濃度依賴性收縮。與對照組(培養基中NaCl濃度為137.65 mmol/L)相比，大鼠冠脈在高鹽培養后(培養基中NaCl濃度為147.65～167.65 mmol/L)由U46619所引發的血管濃度依賴性收縮增強(

P

<0.05)，見圖1A及表1。由ET-1所引發的血管濃度依賴性收縮也增強(

P

<0.01)，見圖1B及表2。這一結果表明，細胞外高鹽環境可增強激動劑誘導的大鼠冠狀動脈的收縮功能。

圖1 高鹽培養對激動劑誘導的冠狀動脈收縮的影響

2.2 高鹽培養對SOCE誘導的冠狀動脈血管收縮的影響

結果如圖2及表3所示，與對照組相比，高鹽培養后SOCE誘導的冠狀動脈濃度依賴性收縮增強(

P

<0.01)。

圖2 高鹽培養對SOCE誘導的冠狀動脈收縮反應的影響與137.65 mmol/L [NaCl] 組比較：**P<0.01

2.3 高鹽培養對RCASMCs中SOCE介導Ca

內流的影響

為了探究高鹽環境下SOCE介導Ca內流的變化，選取使冠狀動脈收縮最強的高鹽濃度(培養基中NaCl濃度為157.65 mmol/L)處理RCASMCs 24 h后做鈣成像實驗，結果如圖3所示，與對照組(F/F=2.70±0.43)相比，高鹽培養(F/F=4.32±0.59)使RCASMCs中SOCE介導的Ca內流增強(

t

=4.477,

P

<0.01)。

圖3 高鹽培養對RCASMCs中SOCE介導的Ca2+內流的影響

表1 高鹽培養對U46619誘導的冠狀動脈收縮的影響

表2 高鹽培養對ET-1誘導的冠狀動脈收縮的影響

表3 高鹽培養對SOCE誘導的冠狀動脈收縮的影響

圖4 高鹽培養后冠狀動脈免疫組化結果 ×400

2.4 IP

R-SOCE相關蛋白的分布和表達

結果如圖4所示，用免疫組織化學方法對不同濃度高鹽培養后的離體冠狀動脈進行染色，放大400倍視野觀察，Orai1、STIM1、IPR和ET于冠狀動脈平滑肌層均有分布，與對照組相比，高鹽培養后，Orai1、STIM1和IPR的表達增強(

P

<0.05)，ET的表達有增強趨勢，但差異無統計學意義。

3 討論

現有證據表明鈉攝入量與血壓值之間存在直接關系，過量的鈉攝入已被證明會引發血壓的顯著增加，并與缺血性心臟病的發病及其心血管并發癥有關。高鈉攝入及血壓水平升高與保水、全身外周阻力增加、內皮功能改變、大彈性動脈結構和功能改變、交感神經活動改變、心血管系統自主神經調節有關。一些研究表明，在高鈉攝入期間，體內鈉含量的增加雖然很小，也許是暫時的，但仍可能高于低鈉攝入期間，無論是在人類還是在實驗模型中，鈉可能在體內積累，而不伴隨著水的滯留。此外，雖然體內鈉可能增加的位置尚不清楚，但一些鈉可能存在于細胞內，而很大一部分可能在細胞外液中。最近的研究表明，鈉血漿水平的變化不僅對小阻力動脈產生影響，而且還可能影響大彈性動脈的功能和結構。

生理情況下，當第一信使(如內皮素和血栓環素)激活細胞膜上G蛋白偶聯受體，下游第二信使1，4，5-三磷酸肌醇(IP)激活內質網上的 IPR引起內質網中的Ca釋放到胞質中引起血管收縮，鈣庫操縱的鈣通道(store-operated calcium channel，SOCC)是細胞膜鈣通道的一種，其開放與胞內鈣庫的釋放密切相關，是血管收縮機制之一，而Orai1、STIM1是SOCE作用的關鍵蛋白。病理情況下冠狀動脈的粥樣硬化處由于內皮損傷和血小板聚集后能夠釋放如內皮素和血栓環素等強烈的縮血管因子，通過G蛋白偶聯受體發揮收縮血管的作用，導致局部嚴重的冠脈痙攣，因此G蛋白偶聯受體-IPR-SOCE作用是調節冠脈血管張力不可忽視的因素。血管平滑肌細胞的增殖、遷移的調節都與SOCE密切相關，更有動物研究表明在肺動脈高壓以及自發性高血壓的疾病大鼠，肺動脈及胸主動脈收縮張力增加與SOCE作用增強有關。

ET-1對血管平滑肌上ET受體的主要作用是促進血管收縮、高血壓、纖維化、炎癥改變以及動脈粥樣硬化。缺血性心臟病患者冠狀動脈ET和ETB受體水平顯著高于充血性心衰患者及正常對照組。高鹽誘導高血壓大鼠的外周小動脈收縮張力顯著增加，而SOCE介導的血管收縮對腦基底動脈張力的調節起重要作用。有研究證明了血管激動劑介導的SOCE信號通路在冠狀動脈血管收縮中的作用，發現IPR-SOCE 蛋白水平與冠脈的收縮張力呈現正相關性。本研究顯示高鹽培養離體冠脈后，激動劑(U46619、ET-1和CaCl)誘導的血管收縮力增強, SOCE介導的Ca內流增強，冠脈平滑肌層G蛋白偶聯受體ET和下游IPR上調，SOCE蛋白(STIM1和Orai1)上調。所以本實驗中冠脈收縮增強可能由于細胞外高鹽環境引起IPR-SOCE蛋白水平升高及SOCE介導的Ca內流增強有關。

有研究發現生理范圍內細胞外NaCl濃度增加可通過Na/Ca反向交換促使Ca進入細胞(而不是內鈣釋放)從而增強5-HT誘導的冠脈收縮，而細胞外NaCl濃度進一步升高時由于離子張力增加冠脈血管張力卻是下降的。本研究中在NaCl濃度為137.65～157.65 mmol/L時，隨著鹽濃度的提高，激動劑誘導的冠脈收縮依次增強，Orai1、STIM1和IPR蛋白在冠狀動脈平滑肌的表達依次上調，而當鹽濃度進一步提高到167.65 mmol/L時，激動劑誘導的冠脈收縮較低濃度NaCl組反而有所下降，相應的蛋白表達下調，這可能與離子強度的過度增加有關，并可能掩蓋細胞外NaCl的生理增加對冠狀動脈血管收縮的顯著影響。