LncRNA H19對大鼠胰腺腺泡細胞AR42J細胞凋亡的影響

王小蝶，余維麗，王福貴，孫 昀

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是胰腺的炎癥性疾病，嚴重時可引起全身炎癥反應綜合征，可導致單個或多個器官功能障礙，甚至死亡。AP的特征是蛋白酶異常激活、實質損傷、胰腺自身消化、胰腺腺泡細胞凋亡和壞死以及強烈的炎癥反應。目前AP的治療方法有液體復蘇、營養支持等，尚無針對性藥物治療。而長鏈非編碼 RNA( long non-coding RNA, LncRNA)是由200多個核苷酸組成，參與調節了許多細胞過程，如細胞凋亡、增殖、自噬等。許多研究已發現LncRNAs參與了多種生物學和病理過程。LncRNA H19是位于染色體11P15.5上的母系表達印記基因轉錄而來，并在某些疾病中發現了H19的上調，例如肝癌、食管癌、動脈粥樣硬化、骨關節炎等。然而，LncRNA H19是否可以通過調節胰腺腺泡細胞凋亡從而參與AP的發生發展尚不清楚。該研究擬探討LncRNA H19在大鼠胰腺腺泡細胞AR42J細胞凋亡中的作用機制，以期為AP的發病機制以及臨床診療提供理論依據和思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大鼠胰腺腺泡細胞AR42J購于上海富衡細胞庫。LncRNA H19的siRNA(si-H19)，siRNA對照(si-NC)，空載質粒對照(pEX-3)以及過表達H19(pEX-3-H19)序列均購于上海吉瑪制藥技術有限公司。Lipofectamine 2000購于美國Life Technology公司；Opti-MEM(x1)培養基購于美國Gibco公司。雨蛙素粉末購于北京索萊寶科技有限公司；qRT-PCR試劑盒購于日本Takara公司。Caspase 3、Caspase 9以及β-Actin抗體均購于武漢三鷹生物技術有限公司。Annexin-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購于上海七海復泰生物科技有限公司。

1.2 細胞培養與轉染

AR42J細胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，置于37℃、5%CO恒溫培養箱中，每2～3 d傳代1次。取對數生長期細胞接種至6孔板，待細胞長至60%～80%匯合度后，根據Lip2000說明書進行轉染，轉染成功后用雨蛙素(100 nmol/L)刺激24 h，處理好的細胞進行后續實驗。實驗分為6組記為：空白對照組(不做任何處理的AR42J細胞)、雨蛙素組、si-NC +雨蛙素組、si-H19+雨蛙素組、pEX-3+雨蛙素組、pEX-3-H19+雨蛙素組。

1.3 qRT-PCR檢測各組細胞中H19及凋亡相關基因Caspase 3及Caspase 9的蛋白的mRNA水平

取處理好的各組細胞，按照TRIzol試劑操作說明書提取細胞中總RNA。后逆轉錄成cDNA備用，流程參照逆轉錄試劑盒說明書。按照表1所示引物序列采用熒光定量PCR擴增儀按照以下條件進行熒光定量PCR反應，95℃、30s，95℃、5s，60℃、20s，共40個循環；95℃、1s，60℃、15s，95℃、5s，反應結束后以GAPDH基因作為內參照，計算H19、Caspase3及Caspase9的mRNA相對表達量。見表1。

表1 H19、Caspase3 、Caspase9以及GAPDH的qRT-PCR的引物序列

1.4 Western blot 法檢測各組細胞中凋亡相關基因Caspase 3及Caspase 9的蛋白的表達水平

取處理好的各組細胞，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，用BCA 試劑盒進行定量。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜。用5%脫脂牛奶在搖床上室溫封閉2 h后TBST洗3×10 min。用相應的一抗在4℃條件下孵育過夜。再用TBST洗3×10 min，用相對應二抗內室溫搖床下孵育膜1 h，用TBST洗滌10 min×3次后，用ECL化學發光底物顯影檢測蛋白。最后用Image-J圖像處理系統分析并以β-Actin作為內參照計算 Western blot灰度值。

1.5 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況

取處理好的各組細胞，加入適量胰酶消化(不含EDTA)，輕輕吹打細胞后500 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 ml PBS重懸細胞，500 r/min離心5 min，收集細胞。加入400 μl Binding Buffer重懸細胞，再每組加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育15 min。最后加入10 μl PI染色液冰浴避光5 min。在30 min內進行CytoFLEX流式細胞儀檢測，用CytExpert分析軟件分析實驗結果。

2 結果

2.1 沉默及過表達H19后各組中H19、Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達水平

與空白對照組相比，雨蛙素組中的H19、Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達水平增高(

F

=9.097、25.58、58.10，

P

均<0.05)；雨蛙素組、si-NC+雨蛙素組、pEX-3+雨蛙素組中的H19、Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達水平差異無統計學意義；而與si-NC+雨蛙素組相比，si-H19+雨蛙素組中的H19、Caspase 3及Caspase 9水平下降(

F

=21.11、50.71、125.3，

P

均<0.05)；反之，與pEX-3+雨蛙素組相比，pEX-3-H19+雨蛙素組中的H19、Caspase 3及Caspase 9水平升高(

F

=49.51、60.12、45.21，

P

均<0.05)，見圖1。即說明H19沉默后，凋亡相關基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA水平下降，而過表達H19后，凋亡相關基因Caspase 3及Caspase 9的mRNA水平上升。

圖1 qRT-PCR檢測AR42J細胞中的H19、Caspase 3以及Caspase 9的mRNA表達

2.2 沉默及過表達H19后各組中Caspase 3及Caspase 9的蛋白表達水平

與空白對照組相比，雨蛙素組中的Caspase 3及Caspase 9蛋白水平增高(

F

=5.182、37，

P

均<0.05)；雨蛙素組、si-NC組+雨蛙素組、pEX-3+雨蛙素組中的Caspase 3及Caspase 9蛋白水平差異無統計學意義；而與si-NC組+雨蛙素組相比，si-H19+雨蛙素組中的Caspase 3及Caspase 9蛋白水平下降(

F

=11.17、34.13，

P

均<0.05)；反之，與pEX-3+雨蛙素組相比，pEX-3-H19+雨蛙素組中的Caspase 3及Caspase 9蛋白水平升高(

F

=11.02、42.02，

P

均<0.05)，見圖2。即說明H19沉默后，凋亡相關基因Caspase 3及Caspase 9的蛋白水平下降，而過表達H19后，凋亡相關基因Caspase 3及Caspase 9的蛋白水平上升。

2.3 沉默及過表達H19后各組中細胞的凋亡率

與空白對照組相比，雨蛙素組的細胞凋亡率增高(

F

=23.68，

P

<0.05)；雨蛙素組、si-NC組+雨蛙素組、pEX-3+雨蛙素組中的細胞凋亡率差異無統計學意義；而與si-NC組+雨蛙素組相比，si-H19+雨蛙素組的細胞凋亡率下降(

F

=49.84，

P

<0.05)；反之，與pEX-3+雨蛙素組相比，pEX-3-H19+雨蛙素組的細胞凋亡率升高(

F

=108，

P

<0.05)。見圖3。即說明H19沉默后，細胞凋亡率下降，而過表達H19后，細胞的凋亡率明顯上升。

圖2 Western blot 法檢測各組中AR42J細胞中Caspase3、Caspase9的蛋白表達水平

3 討論

有證據表明，LncRNAs參與了AP的發生和發展。然而，LncRNA H19在AP中的潛在機制尚不清楚。

LncRNAs已被證明是基因表達的主要調節因子，在包括癌癥在內的各種生物功能和疾病過程中起著關鍵作用。LncRNA H19是一種印記的母系表達的轉錄物，是少數特征明確的LncRNA之一。H19的異常表達與多種疾病有關，且H19在炎癥相關疾病中的表達水平通常較高。Wang et al實驗發現，在類風濕性關節炎患者的滑膜組織中檢測到H19的高表達，而磷脂酰肌醇 3 激酶(PI3K)可調控H19的水平抑制滑膜細胞的增殖及凋亡。而在乳腺癌中，H19的下調還可抑制參與細胞周期調節的p53的表達。在精原細胞的缺氧復氧模型中，H19在細胞復氧后顯著增加，沉默了H19后，小鼠的精原細胞的凋亡水平明顯增加。也有研究發現，H19在缺血再灌注的心肌細胞中上調，且敲除H19 可增加細胞活力，減少細胞凋亡，減少炎癥細胞因子(白介素-1β、腫瘤壞死因子和白介素-6)，抑制氧化應激。另一項實驗表明，LncRNA H19作為miR-148b的上游，可調節WNT/β-連環蛋白信號通路，以促進氧化低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌細胞的增殖并抑制其凋亡。半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)能夠啟動和維持細胞凋亡, 而其家族成員Caspase 3是最重要的凋亡蛋白酶之一, 通常位于哺乳動物細胞凋亡通路下游, 其表達量直接反映細胞凋亡程度。Caspase 3 可被Caspase 9直接激活，通過其自身介導的信號傳導途徑導致細胞發生凋亡。本研究用雨蛙素刺激在體外建立AP模型，與空白對照組相比，在雨蛙素刺激24 h后發現了H19的表達增高。本實驗通過細胞轉染成功獲得H19沉默的AR42J細胞株，而沉默H19 后，Caspase 3及Caspase 9的表達水平下降，AR42J細胞凋亡水平下降，而過表達H19后，AR42J細胞凋亡水平上升。本研究說明H19可能參與并調控胰腺腺泡細胞的凋亡，這與上述文獻一致。

圖3 流式細胞術檢測沉默及過表達H19后各組中細胞的凋亡率

綜上所述， H19在AP的發展過程中高表達，沉默了H19后可下調Caspase 3及Caspase 9的表達，減少雨蛙素刺激引起的細胞凋亡，進而對大鼠胰腺腺泡細胞起到保護作用。本研究初步探討了LncRNA H19在調節胰腺腺泡細胞凋亡的分子機制的認識，未來可深入研究H19的上游或下游靶基因，進一步探討H19參與腺泡細胞凋亡的具體作用機制，以期為AP的臨床診療提供一定的理論依據。