BEX1和BEX4在口腔鱗狀細胞癌中的表達與臨床意義

吳江恩，后 軍 ，薛浩偉，胡玉坤，孫 明

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種極為常見的發生于口腔部位的惡性腫瘤，約90%的口腔惡性腫瘤都是口腔鱗癌。DNA高度甲基化是口腔癌中抑癌基因失活的常見表觀遺傳機制，通過影響轉錄降低基因表達水平。腦表達X染色體連鎖蛋白(the brain-expressed X-linked protein, BEX)是一種保守性較高的小分子蛋白家族，研究發現了包括BEX1、BEX2、BEX3、BEX4、BEX5在內的BEX蛋白家族，因為CG區域在BEX家族基因的啟動子區中富集，導致這一家族的蛋白極易受到包括甲基化等在內的表觀遺傳學調節的影響，抑癌基因的啟動子CG區域廣泛甲基化是惡性腫瘤發生特性，亦是調節抑癌基因功能失活的主要方式。作為易受甲基化調節的小分子信號蛋白，在口腔鱗癌發生、發展過程中存在表達差異。目前研究表明其中BEX1在室管膜瘤、食管鱗癌、口腔鱗癌中低表達；BEX4在肺腺癌、胃癌、口腔鱗癌中低表達。該研究從BEX1和BEX4蛋白在口腔鱗狀細胞癌患者中的表達水平，探討其與口腔鱗癌發生、發展的關系，進而提供與口腔鱗癌的診斷相關的臨床治療依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料

本實驗收集了55例2015年1月—12月期間，安徽醫科大學第一附屬醫院病理科與OSCC相關的石蠟包埋樣本，同時選擇了30例癌旁非腫瘤組織作為本次實驗的對照組。患者在手術治療前均未進行化學治療或其他的抗腫瘤治療，在手術后均未發生圍術期死亡的問題。上述病例中，女性20例，男性35例；年齡32～85(64.57±6.54)歲；低分化17例，中分化18例，高分化20例 ；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移30例；舌癌25例，牙齦癌15例，頰癌15例；根據口腔癌和口咽癌的國際抗癌聯盟(UICC)第8版TNM分類分期標準進行判斷，其中有24例處于Ⅰ期，10例患者處于Ⅱ期，11例患者處于Ⅲ期，10例患者處于Ⅳ期。本次研究所選用的實驗樣本均經本院倫理委員會審批，且患者已經簽署了知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人BEX1抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，工作滴度1 ∶50；兔抗人BEX4抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司，工作滴度1 ∶50；免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Olympus光學顯微鏡購自日本 Olympus 公司。

1.3 實驗方法

所有免疫組化標本均經10%福爾馬林溶液固定24 h，石蠟包埋機包埋組織，切成4 μm的連續切片，行免疫組織化學染色。采用免疫組化SP法，主要實驗步驟如下：石蠟切片脫蠟和水化后，經檸檬酸鈉溶液高壓加熱進行抗原修復 2 min，置室溫下自然冷卻，每張切片滴入3% HO作用10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性。每張切片滴入非免疫動物血清，以減少非特異性染色。滴加一抗(BEX1、BEX4)4 ℃冰箱過夜孵育，每張切片經PBS清洗后滴加生物素標記的二抗，放入37 ℃溫箱孵育30 min，滴加 DAB顯色，再使用蘇木精染色液對切片進行復染，常規脫水中性樹脂封片，在鏡下觀察其染色狀態。

1.4 結果判定

將細胞質中出現可見棕黃色顆粒狀物質沉淀作為判斷陽性BEX1與BEX4免疫反應的依據，同時計數出現陽性反應的細胞；隨機選擇5個未出現重復視野的組織進行免疫組化切片觀察，同時計數所選視野內的細胞。以半定量積分法作為判斷依據判斷最終的結果，同時由2名資歷較深的病理科醫師對其進行打分，陽性細胞數處于70%～100%的計為3分；50%～70%區間的計為2分；10%～50%區間的計為1分；<10%的計為0分；而根據染色強度對其進行評分，棕褐色細胞為3分，黃褐色計為2分，淺黃色計為1分，未染色計為0分。假如細胞兩項指標的乘積總分<3分記為陰性反應，≥3分為陽性反應。

1.5 Kaplan-Meier生存分析

Kaplan-Meier plotter是一個綜合的在線平臺，來源于數據庫GEO、EGA和TCGA，21種癌癥樣類型評估54 000多個基因對生存的影響。本研究使用Kaplan-Meier繪圖分析BEX1和BEX4在口腔鱗癌患者中的表達情況及預后的相關性。從TCGA數據庫獲得212例口腔鱗癌組織和287例癌旁非腫瘤組織中 BEX1 mRNA表達數據以及132例口腔鱗癌組織和367例癌旁非腫瘤組織中BEX4 mRNA 表達數據。

1.6 String-DB數據庫

String數據庫(https://string-db.org/)常用于對基因與蛋白質間的相互作用進行分析，該數據庫中不僅涵蓋了蛋白質間的間接功能相關性，同時也涵蓋了蛋白質間的直接物理相互作用。該數據庫不僅含有從PubMed及其他數據庫中所挖掘的數據及相關實驗數據，同時還含有通過生物信息學的方法進行預測的結果。在本次實驗中，物種選擇為“人類”，分別輸入BEX1與BEX4，選擇Medium 0.4的置信度，同時選擇10的最大相互作用數。

1.7 統計學處理

應用SPSS 24.0軟件進行統計分析。選用χ的檢驗方式對臨床病理學參數與BEX1和BEX4蛋白的表達間的關系進行檢驗；使用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗法分析 BEX1和BEX4表達量差異與患者預后的關系。以

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BEX1和BEX蛋白在OSCC組織及癌旁非腫瘤組織中的表達

在免疫組化實驗中，BEX1和BEX4的表達定位于細胞質(圖1)。BEX1和BEX4在癌旁非腫瘤組織陽性表達率明顯高于OSCC陽性表達率 ，BEX1和BEX4在OSCC組織與癌旁非腫瘤組織相比差異均有統計學意義(

P

<0.01)(表1)。

圖1 OSCC組織和癌旁非腫瘤組織中BEX1和BEX蛋白免疫組化結果SP×200

2.2 BEX1和BEX4表達與OSCC臨床病理參數

之間的相關性

BEX1和BEX4蛋白的表達和OSCC的分化程度、是否出現淋巴結轉移以及臨床分期存在著一定的相關性，且其中的差異有統計學意義(

P

<0.05)，同時BEX1與BEX4蛋白的表達與患者的年齡、發病部位及性別等無相關性，見表2。

表1 BEX1蛋白和BEX4蛋白在OSCC組織和癌旁非腫瘤組織組織中的表達(n)

圖2 基于BEX1、BEX4的總生存期Kaplan-Meier生存曲線

表2 BEX1和BEX4的表達與OSCC臨床病理參數的關系[n(%) ]

2.3 BEX1和BEX4在OSCC中表達的關聯性

關聯性分析顯示， BEX1和BEX4的表達關聯強度為0.489(

P

<0.001), 差異有統計學意義(表3)。

2.4 BEX1和BEX4 Kaplan-Meier生存分析

使用生物信息學在線工具，利用Cox比例風險回歸和通過繪制Kaplan-Meier生存圖來計算基因表達與生存之間的相關性，結果(圖2)表明BEX1低表達的患者生存率更差。BEX4表達與生存率無顯著關系。

表3 BEX1蛋白和BEX4蛋白在口腔鱗癌組織表達關聯性(n)

2.5 BEX1和BEX4相互作用蛋白網絡

根據方法部分的輸入，得到如下結果:BEX1:PPI富集

P

=0.001 55(圖3)。其中在PPI網絡中與BEX1相互作用的蛋白有OMP、TCEAL5、LDB2、LDB1、NHLH2、TRAF6、RIPK2、NGF等，在細胞周期和神經元分化中起作用。抑制對神經生長因子(nerve growth factor,NGF)的神經元分化。BEX4:PPI富集

P

=0.000 258。其中在PPI網絡中與BEX4相互作用的蛋白有TEX19、TCEAL7、MAP7D3、ATXN3L、FAM47B、SATL1、ITIH6等，主要參與了參與控制細胞周期進程和基因組穩定性。

3 討論

發生于口腔位置的惡性腫瘤均可被稱為口腔癌，其中最為常見的便是OSCC，OSCC常見于牙齦、頰等位置，患者的發病部位會出現硬結、潰瘍等癥狀，晚期患者甚至可出現頸部淋巴結轉移或腫瘤細胞的遠處轉移。BEX家族因子高度同源，多項研究發現BEX因子多位于細胞質、細胞核內，并可在不同細胞器間動態穿插，參與多種信號通路，推測其起到信號中介體作用。由于BEX家族基因啟動子區富含CG區域，易受到甲基化等表觀遺傳學調節。現階段關于抑癌基因的研究報道較少，近些年國內有學者研究發現E-cadherin在OSCC中的表達較癌旁組織顯著降低，推測可能起到抑制癌基因的作用。本文研究BEX1和BEX4在口腔鱗癌中的表達情況，為口腔鱗癌的臨床診斷提供幫助。

圖3 BEX1和BEX4相關蛋白網絡圖

目前，Geng et al研究結果表明在食管鱗癌組織中BEX1蛋白的表達程度較低，且該蛋白的表達情況與T分期等情況呈負相關的關系。生存分析研究結果表明，BEX1蛋白表達水平較低，可提示食管鱗癌患者的術后預后效果較差。Zhang et al研究表明BEX家族在肺腺癌組織中的表達水平明顯低于正常組織，BEX1、BEX4和BEX5的低表達水平與某些病理特征有關，尤其是在晚期肺腺癌中。生存分析表明，BEX家族成員，特別是BEX4，在臨床早期和晚期都參與了肺腺癌患者的預后。這種表達模式可能作為肺腺癌患者診斷和預后的潛在標志物。Zhu et al研究表明BEX4在胃癌中低水平表達，BEX4低表達預測胃癌的生存率較差，它是診斷和預后胃癌的有價值的分子預測因子。

本研究分析了55例OSCC組織及30例癌旁非腫瘤組織中BEX1蛋白表達水平。結果顯示45.45%的OSCC組織中BEX1蛋白陽性表達，BEX1蛋白表達水平在 OSCC中的表達較癌旁組織降低。Lee et al研究結果表明，在與咀嚼檳榔、抽煙及飲酒相關的OSCC標本中，BEX1蛋白的表達程度較低，且有著較為顯著的甲基化程度，啟動子甲基化使BEX1和LDOC1失活可能代表了OSCC分子發病機制中的關鍵，這與其研究結果基本相符合。其BEX4蛋白在OSCC組織中陽性表達為34.55%，且在中低分化、有淋巴結轉移組明顯低表達, 表明隨著OSCC惡性程度的提高，BEX4表達水平越低，可能預示OSCC分期越晚。Gao et al研究顯示，BEX4通過抑制口腔癌細胞增殖和生長而起到抑癌作用，BEX4的減少導致OSCC增殖傾向增加。本研究表明BEX1和BEX4蛋白的表達與OSCC分期、淋巴結的轉移以及腫瘤分化程度相關，差異有統計學意義(

P

<0.001)。對BEX1和BEX4之間的相關性分析結果顯示，OSCC組織中 BEX1蛋白表達水平與BEX4蛋白表達水平差異有統計學意義，關聯強度為0.489(

P

<0.001)，說明分析BEX1和BEX4有助于OSCC患者的診斷及預后評價。通過GEPIA分析BEX1和BEX4表達水平對OSCC總體生存率的影響，顯示BEX1低表達的患者其預后有較差的趨勢，意味著更短的總生存期(

P

<0.05)，BEX4表達與總體生存率無顯著關系。

綜上所述，BEX1和BEX4在OSCC組織中低表達，且BEX1低表達提示OSCC患者預后較差，可能作為OSCC臨床診斷及預后的關鍵因素。