Sparc對瘢痕疙瘩成纖維細胞以及正常人皮膚成纖維細胞增殖凋亡及Ⅰ型、Ⅲ型膠原分泌影響的研究

朱曉璇，李心怡，王佳妮 ，丁以春，李小靜*

病理性瘢痕是由于皮膚創傷過度愈合導致的，分為增生性瘢痕及瘢痕疙瘩，瘢痕疙瘩形成的原因主要是成纖維細胞的過度增生，以膠原蛋白為主的細胞外基質的過度沉積。Sparc蛋白是細胞基質相互作用的重要媒介物。現有實驗證明Sparc在肺、真皮、腸、眼睛等纖維化病變組織中呈現高表達。課題組前期研究已初步證明了Sparc與病理性瘢痕形成的相關性，其在病理性瘢痕中存在高表達，可促進正常皮膚以及病理性瘢痕成纖維細胞的增殖，并且能促進增生性瘢痕中Ⅰ型膠原的表達。但其對正常皮膚以及瘢痕疙瘩Ⅲ型膠原的影響尚不明確。該研究通過探討Sparc蛋白對瘢痕疙瘩纖維化的影響，為研究其作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮切取的人體瘢痕疙瘩組織以及植皮手術中正常皮膚組織，均來自于安徽醫科大學第一附屬醫院門診及病房自愿行瘢痕疙瘩切取手術以及植皮手術的患者，其中瘢痕疙瘩患者局部無感染潰瘍，沒接受過任何藥物及放射治療。所有標本取材均已獲得患者本人或監護人的知情同意。實驗對所有樣本的處理方法符合國家衛生和計劃生育委員會印發的《涉及人的生物醫學研究倫理審查辦法》。

1.2 試劑

CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(美國Sigma)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海生工科技)，重組人Sparc蛋白(美國Biorbyt公司)，人Ⅰ型膠原抗體、人Ⅲ型膠原抗體(北京康為世紀)。

1.3 方法

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3

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人瘢痕疙瘩成纖維細胞(human keloid fibroblasts, HKF)的分離培養 于超凈工作臺無菌條件下手術切取新鮮瘢痕疙瘩組織，去除髓核、表皮以及血管等結締組織，將其切割成約2～3 mm大小置于培養皿中，用PBS清洗2次后以1～2塊組織/cm的密度排列整齊，每顆組織塊表面滴加1～2滴胎牛血清浸潤，置于37°C、5%CO培養箱中培養6～8 h后組織塊貼壁，加入適量含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養過夜，第二日觀察培養基無污染后換液，之后每2～3 d換液1次，1周后觀察有成纖維細胞組織遷移出來，待貼壁生長達80%以上時即可傳代。

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2

正常人成纖維細胞(normal fibroblasts, NFs)的分離培養 與超凈工作臺無菌條件下處理手術切取新鮮皮膚組織，去除表層皮膚等結締組織，實驗方法同1.3.1。

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3

加入Sparc蛋白處理HKF以及NFs 取3～5代呈對數生長期的細胞，待細胞生長至貼壁達80%～90%時胰酶消化，用含15%體積分數胎牛血清的DMEM調整細胞濃度至2×10個/ml接種于96孔板中，每孔100 μl，待細胞貼壁后加入Sparc蛋白培養72 h，將細胞分為實驗組與對照組，實驗組加2 μg/ml的重組人Sparc蛋白，對照組加入等量培養基，每組設4個復孔。

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3

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4

CCK-8檢測細胞增殖 將細胞以3×10個/孔的密度均勻鋪至96 孔板中，每組共設8個孔。放入 37℃、5% CO細胞培養箱正常培養12 h至細胞貼壁，形態正常。排槍吸去培養基中舊液，用PBS 緩沖液沖洗2次，對照組加入正常培養基, 實驗組加入含Sparc蛋白2 μg/ml的培養基。孵育72 h 后，用排槍吸出各組培養液后，加入按10 %濃度配制的CCK-8溶液混合液，每孔加入混合液100 μl，37℃孵育30 min。調節分光光度計，于450 nm 波長處，檢測吸光度(optical density, OD)值。

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3

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Annexin V

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FITC/PI雙染細胞實驗 將細胞培養基轉移至15 ml離心管中，用2 ml PBS輕輕潤洗細胞，棄去PBS。加入胰酶消化細胞后，用預冷的PBS洗滌細胞2次，棄去PBS。用400 μl的Annexin V結合液懸浮細胞，密度約為1×10個細胞/ml。在細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液混勻，4℃避光孵育15 min。加入10 μl PI染色液混勻，4℃避光孵育10 min。立即使用流式細胞儀檢測凋亡率。

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3

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6

Western blot實驗檢測各組細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達 分別收集HKF以及NFs的實驗組與對照組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。制備好的蛋白樣品經SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至聚氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉37 ℃封閉1.5 h后，加入1 ∶2 000稀釋的Ⅰ型膠原蛋白抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入1 ∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜后與化學發光底物孵育5 min，曝光、顯影、定影。用GAPDH作內參驗證蛋白含量。同樣方法檢測Ⅲ型膠原蛋白的表達。

1

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3

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7

RT-PCR檢測各組細胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的表達 分別收集HKF以及NFs的實驗組與對照組細胞，提取其總RNA，逆轉錄得cDNA，采用SYBR Green法進行RT-PCR。引物根據GenBank中Ⅰ型膠原蛋白基因序列設計：上游引物：5′TACAGCGTCACTGTCGATGGC 3′ ，下游引物：3′TCAATCACTGTCTTGCCCCAG 5′；Ⅲ型膠原蛋白基因序列設計：上游引物：5′AATTTGGTGTGGACGTTGGC 3′，下游引物：3′TTGTCGGTCACTTGCACTGG 5′；內參GAPDH基因序列：上游引物：5′CAACAGCGACACCCACTCCT 3′，下游引物：3′CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA 5′，由上海生工公司合成。反應參數設置為94℃、30 s預變性，94℃、5 s變性，61℃、35 s退火，42℃、45 s延伸，共40個循環。反應產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，以Gel pro凝膠吸光度分析軟件分析，測其OD值，計算Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白表達量。將數據導入Graph Prism 8.0.1軟件采用單因素方差分析獲得柱狀圖。

1.4 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行分析，樣本間差異比較均采用配對樣本

t

檢驗，

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組細胞增殖比較

CCK-8實驗顯示加入Sparc蛋白后，實驗組HKF(

t

=4.371、

P

=0.007)以及NFs(

t

=2.685、

P

=0.044)增殖狀態較對照組增高，差異有統計學意義。各實驗組之間差別不顯著(

t

=2.052、

P

=0.96),差異無統計學意義(圖1)。

圖1 CCK-8檢測細胞增殖結果

2.2 4組細胞凋亡率比較

流式細胞儀結果表明加入Sparc蛋白后，HKF實驗組(

t

=17.591、

P

=0.00)與NFs實驗組(

t

=15.679、

P

=0.00)較對照組細胞凋亡率降低(圖2)，差異有統計學意義。

2.3 Western blot以及RT-PCR檢測各組細胞中Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原表達差異

Western blot實驗結果顯示，與對照組比較，各實驗組Ⅰ型膠原的表達增高，HKF實驗組Ⅲ型膠原的表達增高，而NFs實驗組增高不明顯(圖3)；RT-PCR實驗結果顯示，加入Sparc蛋白后，與對照組比較，實驗組HKF(

t

=5.151、

P

=0.014)以及NFs(

t

=18.502、

P

=0.00)的Ⅰ型膠原表達增高，差異有統計學意義；實驗組HKF(

t

=3.597、

P

=0.037)以及NFs(

t

=11.295、

P

=0.00)的Ⅲ型膠原的表達增高，差異有統計學意義。而各實驗組之間差別不明顯(圖4)。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

圖3 RT-PCR檢測各組細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達結果

圖4 Western blot檢測各組細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達結果

3 討論

瘢痕疙瘩是由于皮膚創傷或自發形成的病理性瘢痕組織，伴隨著成纖維細胞的過度增殖以及細胞外膠原的過度沉積。組織損傷可以通過皮下組織重建或瘢痕的形成來愈合，在皮膚愈合的過程中，成纖維細胞負責將創面邊緣拉緊，并形成創面瘢痕的細胞外基質。這種病理性的改變伴隨著明顯的增長特征：其范圍超過原先的損傷范圍并且持續向周圍正常皮膚組織延伸，類似腫瘤，因此也稱為良性真皮腫瘤。此外，大量研究表明瘢痕疙瘩與多種細胞因子、基因調節、傷口張力、免疫失調以及細胞外基質生成與調節的失衡有關。因此抑制成纖維細胞的增殖以及膠原蛋白的沉積或許是改善瘢痕疙瘩的有效方式，而找到促進成纖維細胞增殖以及膠原蛋白生成的因素至關重要。Sparc蛋白是一種多功能小分子糖蛋白，在體內分布廣泛，可促進損傷后發生的組織重建。最初于1981年被Termine et al作為非膠原成分描述和純化。Sparc可通過調節血管生成、抑制細胞黏附、促進細胞增殖來促進腫瘤組織的生長及侵襲和轉移。目前已有研究證明通過基因沉默的方式靶向抑制成纖維細胞中Sparc蛋白的表達可以抑制硬皮病成纖維細胞的增殖，抑制其Ⅰ型膠原以及Ⅲ型膠原的表達。有研究人員通過Sparc siRNA抑制皮膚成纖維細胞形成和小鼠Sparc基因表達，提出了抑制Sparc表達是抑制纖維化疾病發生的有效途徑。并且既往研究也已初步證實了Sparc蛋白與病理性瘢痕的相關性。因此Sparc蛋白或許可以成為治療病理性瘢痕的新靶點，為病理性瘢痕的治療提供新的思路。本次實驗應用不同實驗方法證實了Sparc蛋白對HKF以及正常皮膚成纖維細胞增殖的促進作用，并且對各實驗組細胞的凋亡起抑制作用。Sparc實驗中Sparc蛋白對于各實驗組細胞Ⅰ型與Ⅲ型膠原表達均有促進作用，而Western blot實驗中Sparc蛋白對各實驗組細胞Ⅰ型膠原表達有促進作用，對于HKF實驗組Ⅲ型膠原表達也有促進作用，但是對于NFs實驗組Ⅲ型膠原表達的促進作用不明顯。以上實驗結果提示Sparc蛋白可以促進HKF以及NFs增殖，抑制其凋亡，并且可以促進HKF以及NFsⅠ型與Ⅲ型膠原的表達。但是Sparc蛋白具體是通過哪種途徑對瘢痕產生促進作用以及敲除此種基因對瘢痕疙瘩形成的影響還有待進一步研究。