多粘類芽孢桿菌LRS-1對番茄青枯病害根際土壤細菌群落的影響

張 亮，向陳艷，袁 紅，譚 麗，易建平

（1. 湖南農業大學資源環境學院，湖南 長沙 410128；2. 醴陵市農業農村局，湖南 醴陵 412200）

番茄青枯病是茄科拉爾氏桿菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種嚴重威脅番茄生產的世界性土傳病害，可致番茄產量嚴重損失以及品質明顯降低[1]。該病害廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區，在我國長江以南各地尤其嚴重，且呈現由南向北蔓延態勢，已成為影響番茄等作物生產的最嚴重病害之一[2]。對番茄青枯病進行傳統防控，效果均不理想，且存在危害生態或人體健康等風險，在此背景下，利用有益微生物抑制病原菌為手段的生物防治成為了人們關注的重點。在番茄青枯病的生物防治研究中，已見報道的多為無致病性的有益微生物，諸如多粘芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、假單胞菌等根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）[3-5]。根際土壤微生物群落結構的多樣性、平衡性是保障作物健康生長的必要條件，土壤病原微生物的長期破壞易致土壤細菌群落特別是有益細菌群落結構和功能多樣性不再平衡合理，從而病害頻發、作物減產[6-9]。然而，人們對于根際促生菌等有益微生物如何影響青枯病害等逆境下微生物組成和功能多樣性演替規律的研究信息尚顯匱乏。多粘類芽孢桿菌LRS-1篩選于酸性水稻土壤，并在前期試驗中發現對疫霉菌、青枯菌等土傳病原菌具有拮抗效果，能夠顯著降低相關土傳病害的病情指數，是優良的生防菌株材料。筆者在此基礎之上，對“根際促生菌-番茄-青枯菌-病土壤微生物”的互作效應進行研究，以期揭示土壤有益微生物對病態根際土壤生態調控的微生物互作機制，為保障土壤生物逆境環境下作物的健康生長和土壤生產力的可持續養護提供十分重要的理論價值與現實指導意義。

1 材料與方法

1.1 供試土壤、病原菌與植株

供試土壤為菜園土，pH值5.8，有機質32.76 g/kg，全氮24.3 g/kg，速效磷23.5 g/kg，速效鉀134 g/kg，采集于長沙縣星港社區居民自種菜地。

供試生防菌為多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）LRS-1(以下簡稱LRS1)，保存于湖南農業大學資源環境學院土壤微生物實驗室；番茄青枯菌（Ralstonia solanacearum）為LK1，由湖南農業大學植物保護學院分離與提供。

供試番茄品種為紅寶石。

1.2 培養基、試劑盒與引物

細菌NBY培養基配制：營養肉湯粉8 g，酵母提取物2 g，磷酸氫二鉀2 g， 磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖2.5 g，1mol/L七水合硫酸鎂 1 mL，加去離子水溶解定容至1 000 mL。試劑盒：土壤基因組DNA提取試劑盒（MP Biomedicals公司）。引物：細菌16S rRNA基因通用引物（奧科鼎盛生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

生防菌接種方法：泥炭根部包裹法[10-11]。即盆栽前，將生防菌接種于NBY培養基，并在26℃、180 r/min條件下培養48 h，隨后經6 000 r/min離心及生理鹽水懸?。?09CFU/mL），由輻照滅菌泥炭粉配制成10%（V∶M）生防泥炭（108CFU/mL），備用。

感病土壤制備方法： 接種病原菌在26℃、180 r/min條件下振蕩培養于NBY培養基48 h，6 000 r/min離心，生理鹽水懸浮（106CFU/mL）后，與過20目篩土壤按1∶10（V∶M）比例混合制備成病土。

盆栽試驗：設3個處理，分別為清水對照處理（CK）、青枯菌陽性對照處理（RS）、生防處理（LRS1+RS），各處理20盆（直徑12 cm）。試驗重復3次。每盆裝入300 g病土，移栽1株根部包裹有生防泥炭粉的番茄幼苗（2葉一心），以不接種的滅菌泥炭粉作為陰性對照，常規管理。

樣品采集：盆栽試驗第30 d時，每個處理隨機挑選10盆番茄植株，挖取根系，剝離根外多余土壤，經抖根法用滅菌毛刷收集緊貼根表的土壤于滅菌錫薄紙內，混勻，液氮保存于－80℃冰箱，備用。

1.4 根際土壤DNA提取

試劑盒法提取根際土壤DNA，經0.8%瓊脂糖電泳檢測，滅菌DERS水稀釋至1 ng/μL。

1.5 16S rRNA 基因V3-V4區RSR擴增

以27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）引 物進行RSR擴增。25 μL RSR反應體系包括：5 μL緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.5 μL引 物（F/R）、0.5 μL DNA模板、0.5 μL聚合酶以及DERS無菌水。RSR運行條件為：94℃ 3 min，30×（94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 90 s），72℃ 10 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。RSR產物純化后由上海美吉生物科技有限公司進行基于Illumina平臺的Miseq測序，完成對16S rRNA基因V3-V4區的檢測。

1.6 原始數據處理與分析

原始數據返回后，利用FLASH軟件對提出引物序列后的剩余序列進行拼接，并通過QIIME軟件進行過濾，與NCBI數據庫中已知序列對比分析，經MEGA 7.0軟件獲得有效序列。隨后利用Usearch軟件對所有序列進行提取，然后對提取出的fasta文件按照97%相似度水平劃分獲得物種OTUs，然后利用RDP在線數據庫，按照RDP數據庫將OTUs進行分類，制作OTU豐度表，并注釋OTU系統學分類名稱。通過美吉生物云平臺分析多樣性指數、Venn圖、物種群落圖、單因素互作網絡關系等。

2 結果與分析

2.1 根際土壤細菌OTU多樣性

Alpha多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，其中包括表征群落豐富度的Ace指數和Chao1指數、表征群落多樣性Shannon指數以及反映群落覆蓋度的指數。如表1所示，CK處理中Chao1指數和Ace指數均為最高，且明顯高于其他兩個處理，說明陰性對照土壤細菌群落豐富度最高，而RS與LRS1兩個處理的土壤細菌群落豐富度下降。Shannon指數以CK處理最高，而RS處理最低，表明陰性對照土壤中細菌群落多樣性最大，青枯病陽性土壤細菌群落多樣性明顯降低，而接種生防菌LRS1則對提高青枯病土細菌群落多樣性有益。此外，接種生防菌LRS1有利于提高土壤細菌群落覆蓋度。

表1 根際細菌α多樣性分析

2.2 根際土壤細菌物種OTUs分布

就OTU水平而言，3個處理共獲得5 081個OTU，其中共同含有1 015個OTU。CK處理獨有1 026個OTU，LRS1處理1 181個OTU，RS處理獨有382個OTU。CK與LRS1共有1 233個OTU，CK與RS共有1 902個OTU，RS與LRS1共有1 387個OTU（圖1）。CK處理OTUs總數最高，LRS1與RS處理OTUs總數相近，但以RS處理OTUs最低。上述結果表明，接種生防菌LRS1有利于促進青枯病害脅迫下的根際細菌組成相似性及其細菌種類組成。

圖1 根際細菌OTUs分布

2.3 根際土壤細菌群落物種差異

根據各處理根際土壤樣本OTU中代表序列的物種注釋結果，選取前10名的物種制成相對豐度柱狀圖。如圖2所示，在門分類學水平上排名前十的細菌分別為：放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、粘孢子門（Myxococcota）等，它們是優勢物種類群。不同處理番茄根際細菌的優勢菌落在門水平上基本相似，但不同處理間細菌群落的結構與相對豐度存在差異。例如放線菌門（Actinobacteria）在3個處理中相對豐度最高，并且占據著絕對的優勢。放線菌門（Actinobacteria）屬于細菌中的革蘭氏陽性菌群，與人類關系密切，分布廣泛，在提高土壤質量與環境保護方面有重要地位。RS處理中放線菌門的相對豐度明顯低于其他兩個處理。在不同處理根際相對豐度中占據第二大類的變形菌門（Proteobacteria）是細菌中最大的門類，其物種和遺傳多樣性極為豐富，在土壤生態系統功能中占據著十分重要的位置（圖2）。

圖2 門水平上的根際細菌相對豐度

如圖3所示，就屬分類水平上平均豐度大于1 %的根際土壤細菌物種而言，CK處理主要有Xanthobacteraceaev、Micrococcaceae、Oryzihumus、Acidobacteriales、Paenarthrobacter、Gaiellales、Mycobacterium、Nocardioides、Gemmatimonas、Terrabacter、Intrasporangiaceae、Pseudarthrobacter、Methyloligellaceae等，未知細菌約占32.99 %；RS處理主要有Xanthobacteraceaev、Ralstrorinia、Micrococcaceae、Paenarthrobacter、Acidobacteriales、Gaiellales、Mycobacterium、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Candidatus_Solibacter等，未知細菌約占35.16%；LRS1處理主要有Xanthobacteraceaev、Micrococcaceae、Oryzihumus、Acidobacteriales、Ralstrorinia、Conexibacter、Gemmataceae、Paenibacillus等，未知細菌約占38.85%。接種多粘類芽孢桿菌LRS1后，Paenibacillus物種在LRS1處理中物種水平明顯提高，占比為2.32%，而病原菌Ralstrorinia物種占比大幅降低。上述結果表明，在青枯病原菌脅迫條件下，接種后的多粘類芽孢桿菌LRS1能夠良好定殖于番茄根際土壤，不僅降低了青枯病原菌物種豐度，還對根際細菌多樣性起到明顯的維持與促進作用。

圖3 屬水平上的根際細菌群落

2.4 根際土壤細菌群落組成的PCA聚類分析

PCA聚類分析結果顯示主成分1（PC1）與主成分2（PC2）對各處理根際土壤細菌群落差異的解釋度不同。對照處理（CK）位于PC1負半軸和PC2正半軸，病原菌處理（RS）位于PC1負半軸和PC2負半軸，多粘類芽孢桿菌LRS1處理（LRS1）總體位于PC1正半軸和PC2正半軸，說明各處理間的根際土壤細菌群落變化明顯（圖4）。

圖4 根際細菌群落的PCA聚類分析

2.5 根際土壤細菌互作網絡分析

群落互作網絡分析結果表明，不同處理間根際土壤細菌群落互作網絡復雜程度（圖5）、網絡異質性（表2）以及網絡互作關系（圖5）均存在明顯差異。與陰性對照（CK）相比，病原菌陽性（RS）處理的網絡相似度最低且群落間負面交互作用明顯增強，而接種多粘類芽孢桿菌LRS1有利于根際細菌群落互作網絡關系的穩定與和諧。

圖5 不同處理根際細菌互作網絡關系

表2 不同處理細菌生態網絡整體性質對比

3 結論與討論

尋求綠色、安全、高效的生物防治手段對作物土傳病害進行防控已成為維護土壤生態和諧與保障土壤肥力發揮的迫切需求[12-13]。此試驗中多粘類芽孢桿菌LRS-1從水稻土壤中分離鑒定，該菌株可對辣椒疫霉菌、黃瓜疫霉菌以及番茄青枯菌等多種土傳病原微生物產生有效的拮抗防病能力，是研究土壤病害防控的良好材料[14-15]。

根際土壤環境對作物生長具有特殊意義，是作物根系與土壤微生物互作最為密切的微生態圈，該域內各類環境因子、根系分泌物以及微生物群落相互影響、相互制約，從而對作物生長起到其他土壤環境無法比擬的作用[16-17]。根際土壤微生物群落結構的多樣性、平衡性是保障作物健康生長的必要條件，土傳病害發生嚴重的土壤受病原微生物的長期破壞導致其土壤中細菌群落，特別是有益細菌群落結構和功能多樣性不再平衡合理，導致病害頻發、作物減產，不僅嚴重威脅土壤生態質量狀況，而且嚴重制約農作物種植產業的可持續發展[18-20]。前期試驗結果顯示接種多粘類芽孢桿菌LRS-1后，該生防菌不僅能力在辣椒根際土壤良好定殖，還對改善辣椒疫霉病害根際土壤微生物多樣性具有積極意義[21]。然而，人們對于根際促生菌等有益微生物如何影響青枯病害等逆境下微生物組成和功能多樣性演替規律的研究信息尚顯匱乏，這是因為外源有益微生物與病態逆境土壤微生物之間，不僅是拮抗菌—病原菌的簡單拮抗，還涉及有益功能微生物菌種屬性以及與土壤中其他未知土著微生物種群間的競爭、協同等復雜關系[18]。

此研究結果表明，接種生防菌LRS-1不僅能夠提高青枯病態根際土壤微生物α指數的豐富度和覆蓋度，還能明顯降低青枯病原菌物種豐度并利于根際細菌群落多樣性的維持穩定。從互作網絡分析結果來看，青枯菌陽性對照處理根際細菌負面互作關系明顯增加，而接種生防菌LRS-1后整體群落共線性網絡趨于穩定，互作關系和諧，這與現有相關報導結論結果相符[22-24]。綜上所述，該研究結果為“生防菌—青枯病原菌—病土微生物”體系互作機理研究提供了參考依據，在保障土壤作物健康生長和土壤生產力可持續養護方面具有重要的理論與應用價值。