響應面法優化復合酶提高上部煙葉可用性的研究

楊 波，沈 嘉，楊繼福，舒俊生，張福建，王紹林，陳 軍，馬 松

（1. 安徽中煙工業有限責任公司，安徽 合肥 230088；2. 安徽省農業科學院煙草研究所，安徽 合肥 2300312；3. 華環國際煙草有限公司，安徽 滁州 233121）

煙葉可用性是評價煙葉原料在卷煙配方中是否好用的一種指標。我國大部分煙區上部煙葉可用性的現狀既提高了卷煙制造成本，又限制了卷煙質量水平。近年來，圍繞提高煙葉上部葉可用性的研究主要在煙草農業方面開展，從品種[1-2]、生態條件[3-6]、栽培技術[7-10]、成熟度[11-13]、烘烤調制[14-15]等方面進行了大量的研究，但上部煙葉普遍存在的結構致密、內在化學成分不協調、勁頭大、刺激性強、工業可用性不高等問題尚未完全解決，伴隨著我國卷煙結構持續提升，上部煙葉大量積壓庫存，如何從工業角度提高上部煙葉可用性已經成為緩解煙葉等級結構矛盾，降低工業庫存的必由之路。

目前，運用生物技術提高煙葉可用性已成為研究熱點。生物技術包括微生物技術和生物酶技術，微生物技術主要是在煙葉醇化過程中添加微生物提高煙草品質，但由于對微生物發酵的本質缺乏深入的基礎研究，加之生產工藝的限制，微生物發酵技術應用于煙草的品質改良還處于試驗研究階段，與實際應用尚有距離。生物酶技術主要是在煙葉中添加外源酶降低煙草中纖維素、淀粉、果膠等成分含量，協調煙葉中各種成分，從而改善煙葉品質。目前，國內外針對生物酶開展了大量研究。BABLER S[16]研究發現在煙葉中施加蛋白酶能降解煙葉中的蛋白質并產生相當數量的氨基酸，煙葉的香氣顯著提高。姚光明[17]研究發現，中性蛋白酶對煙葉中蛋白質的降解作用最為明顯，煙葉的燃吸質量得到明顯改善，對雜氣和苦辣味的消除效果尤為明顯。王繼蓮等[18]用細菌酶制劑處理煙葉，蛋白酶降解18.64%，氨基酸增加12.72%，同時香氣成分不同程度增加。李曉等[19]、閆克玉等[20]研究表明，淀粉酶、糖化酶、纖維素酶和果膠酶對提升煙葉香氣和甜度，改善余味，降低刺激性、枯焦氣等方面效果顯著。謝會雅等[21]、李小斌等[22]用復合酶液處理煙葉，發現其對降解烤煙蛋白質的效果優于α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶等單一中性酶。石志發等[23]用功能潛香劑、風味蛋白酶、糖化酶組合處理上部煙葉效果明顯，煙葉淀粉、蛋白質含量降低，總糖、還原糖含量上升，致香成分增加。楊慶等[24]將糖化酶、纖維素酶、過氧化氫酶、淀粉酶等多種酶液按一定比例復配，添加的煙葉醇化后，煙葉總糖、還原糖、總植物堿、總氮、淀粉和蛋白質含量降低，致香成分總量增加，感官評吸青雜氣減弱，舒適性變好。許春平等[25]用復合酶處理低次煙葉，煙葉總糖含量增加57.23%，蛋白質和總氮含量降低，施木克值增加，雜環類化合物、酮類和酸類增加，煙堿含量降低，煙葉刺激性減少，煙香改善，余味增加。

綜合來看，生物酶制劑可以改善煙葉品質，提高香氣，減少雜氣等不良氣息，提高舒適性。生物酶制劑的使用無疑為工業企業提高上部煙葉可用性提供了一條切實可行的路徑。筆者針對工業企業上部煙葉難使用的現狀，以皖南B3F等級煙葉為研究原料，圍繞上部煙葉普遍存在的質量缺陷，借鑒前人的研究成果，針對性的選擇生物酶制劑，通過不同生物酶制劑的篩選和復合酶制劑的優化，為上部煙葉可用性的提高提供理論參考和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.2 酶使用煙堿脫氫酶、脂氧合酶、蛋白酶、酸性木聚糖酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶共5種不同酶制劑。

1.1.3 主要設備所用主要設備有KBF240恒溫恒濕箱、PL203-C電子天平、空氣壓縮機、燒杯、移液槍、噴槍和托盤等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備（1）處理樣：稱取200 g片煙，均勻鋪放在托盤中；用移液槍移取不同濃度的酶溶液（濃度詳見表1～表5），按煙葉重量的3‰放于燒杯中，并用純凈水稀釋20倍；用噴槍將稀釋后的單酶均勻噴灑在煙片上；將處理后的煙片放入恒溫恒濕箱（溫度40℃，濕度65%）中7 d后取出，在室溫條件下存放40 d進行感官質量評價[26]。（2）對照樣（CK）：將酶液換成純凈水，其他步驟同上。

1.2.2 感官質量評價按照安徽中煙工業有限責任公司《煙葉感官質量評價辦法》進行定量評價和定性描述。定量評價包括香氣特征（香氣質、香氣量和雜氣）、煙氣特征（勁頭、濃度和細膩程度）和口感特征（刺激性、干燥感、余味和甜度），均采用9分制。燃燒性、灰色均采用5分制。試驗重點針對香氣量、香氣質、雜氣和余味進行定量評價和定性描述。

1.2.3 數據處理與分析采用Excel和Design-Expert 10.0.1進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單一酶提高上部煙葉可用性的效果

2.1.1 煙堿脫氫酶由表1可知，煙堿脫氫酶單一酶處理中，當添加濃度在1.0‰～1.2‰時，香氣質感略有提升，香氣量略有增加，余味變得純凈舒適；當添加濃度在1.2‰時，對皖南B3F的綜合改善效果最好，特別是對辛辣刺激性有較明顯的改善。

表1 煙堿脫氫酶對皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.2 脂氧合酶由表2可知，當脂氧合酶的添加濃度在0.12‰～0.14‰時，香氣量略有增加，余味略顯舒適。當添加濃度在0.14‰時，對皖南B3F的綜合改善效果最好，對枯焦氣和辛辣刺激性均有不同程度的改善。當添加濃度在0.16‰時，綜合改善效果最差。

表2 脂氧合酶對皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.3 蛋白酶由表3可知，蛋白酶單一酶處理中，當添加濃度在1.0‰～1.2‰時，香氣質感提升，雜氣特別是枯焦氣降低明顯。當添加濃度在1.2‰時，對皖南B3F的綜合改善效果最好，對枯焦氣和辛辣刺激性均有不同程度的改善。

表3 蛋白酶對皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.4 酸性木聚糖酶由表4可知，酸性木聚糖酶單一酶處理中，當添加濃度在0.4‰～0.6‰時，香氣質感提升明顯，雜氣特別是枯焦氣降低明顯。當添加濃度在0.6‰時，對皖南B3F的綜合改善效果最好，對枯焦氣有不同程度的改善。

在偶像粉絲圈（俗稱飯圈）中的粉絲屬性大致分為三類，分別是唯粉、CP粉和團粉。唯粉，指的是只喜歡團隊中其中一位偶像的粉絲，可能對其他團隊成員沒有好惡感受，也可能帶有強烈的厭惡情緒；CP粉源起于韓國娛樂圈，CP是英文單詞couple的縮寫，CP粉指的是同時喜歡的兩個明星并把他們假想成情侶關系的粉絲，且偶像CP組合方式并不限制性別。團粉即整個偶像團隊的粉絲，團隊中的每一個人都是團粉追捧的對象，因而團粉不接受成員爭端和組合解散。

表4 酸性木聚糖酶對皖南B3F煙葉改善效果 （分）

2.1.5 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶由表5可知，淀粉-1,4-葡萄糖苷酶單一酶處理中，當添加濃度在0.4‰～0.8‰時，香氣量提升明顯，余味變得純凈舒適。當添加濃度在0.4‰時，對皖南B3F的綜合改善效果最好，對枯焦氣、辛辣刺激性有不同程度的改善。

表5 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶對皖南B3F煙葉改善效果 （分）

由單因素試驗結果可以看出，對皖南B3F上部煙葉的枯焦氣和辛辣刺激性改善明顯的主要是蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶，3種酶的適宜濃度分別為0.8‰～1.2‰、0.4‰～0.8‰和0.1‰～0.14‰。

2.2 響應面試驗因素水平和結果

為進一步研究變量之間交互作用的影響關系，使用響應面分析法優化最佳復合酶組合。每個單因素的初步研究是響應面優化的指導范圍，基于Box-Benhnken采樣原理，選擇對感官質量得分有顯著提高的3個因素：蛋白酶（A）、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶（B）、脂氧合酶（C）進行三因素三水平的響應面分析試驗（表6和表7）。

表6 響應面試驗因素水平和編碼

表7 試驗設計與結果

利用Design-Expert 10.0.1軟件對實驗數據進行分析，得到二次多項回歸方程：得分=22.64+0.05×A+1.867 66×10-15×B-0.075×C-0.2×AB-0.05×AC+8.871 66×10-16×BC-0.72×A2-0.52×B2-0.72×C2（編碼制）。

對方程進行回歸分析可知（表8），F值可用來檢驗各變量對響應值影響的顯著性的高低。F越大，則相應變量的顯著程度越高。當模型顯著性檢驗值P＜0.05，說明該模型具有統計學意義。從表8可以看出，對感官質量得分影響大小順序為：C＞A＞B，即：脂氧合酶＞蛋白酶＞淀粉-1,4-葡萄糖苷酶。模型的決定系數R2為0.994 2，說明模型具有高的顯著性，而R2adj=0.986 8，能夠解釋實驗98.68%的響應值變異，且與預測相關系數R2Pred也接近，說明此響應模型具有較高擬合精度，與真實數據擬合程度良好，具有實踐指導意義，由此可以用該模型分析和預測改善效果最明顯的復合酶制劑。

表8 響應面擬合回歸方程的方差分析

響應面是響應值對各因素所構成的三維空間曲面圖，可直觀反映各因素及因素交互作用對結果的影響。不同酶的復配組合對感官質量得分的影響見圖1～圖3。從圖1中可以看出，蛋白酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互作用對得分的影響呈拋物面分布，當蛋白酶一定時，隨著淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的增加，得分呈現先上升后下降的趨勢。同理，當淀粉-1,4-葡萄糖苷酶不變時，隨著蛋白酶的提高，得分也呈現先增加后減小趨勢。在二者交互作用下，蛋白酶引起曲面更大幅度波動，對得分影響更大。僅考慮二者因素作用下的最優組合范圍為：蛋白酶為0.95‰～1.05‰，淀粉-1,4-葡萄糖苷酶為0.7‰～0.9‰水平范圍內。圖2所示的交互響應面中，蛋白酶和脂氧合酶的變化均引起得分先增后減波動。相較于圖1，二者整體波動幅度相對較大，說明蛋白酶與脂氧合酶交互作用對得分的影響要大于蛋白酶與淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互影響。當蛋白酶取1.0‰水平、脂氧合酶C取0.12‰水平附近的值時，該組合作用下的得分最高。由圖3，交互曲面整體也呈一拋物曲面，可以看出，當淀粉-1,4-葡萄糖苷酶不變時，脂氧合酶引起曲面幅度變化更大，換言之，在交互作用中脂氧合酶的貢獻率更大，實際酶的復合過程控制中應重點關注該影響較大的因素，設置合理的酶的復配方式。當設定淀粉-1,4-葡萄糖苷酶在0.7‰～0.9‰，脂氧合酶在0.115‰～0.125‰時，得分最高，應控制該條件從而得到最佳復配組合。

圖1 蛋白酶和淀粉-1,4-葡萄糖苷酶的交互作用對感官得分的影響

圖3 淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶的交互作用對感官得分的影響

為進一步精準確定全局最優解，以得分最高為優化目標，根據分析結果，得分在蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶、脂氧合酶的共同影響下的最優酶的組合為蛋白酶1.0‰、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶0.8‰、脂氧合酶0.12‰，在此條件下模型預測的最大得分為22.64分。在最優酶的組合下，皖南上部煙葉香氣質提升明顯，刺激性降低，勁頭降低，雜氣減輕，煙氣明顯柔和細膩，質量有明顯提高。

3 討 論

從研究結果來看，生物酶能夠改善煙葉感官質量，增加煙草香味物質，減輕雜氣和刺激性，生物酶的主要作用體現在生物酶能夠促進煙葉中纖維素、果膠、淀粉等的生物轉化，協調煙草中化學成分，降解煙草中的有害成分并提高煙葉香氣成分。

單因素試驗結果表明，蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶這3種單一酶對上部煙葉改善效果較好，這與前人研究結果[16-21]一致。3種單一酶的作用機理不同，蛋白酶主要將煙葉中蛋白質長的肽鍵分解成短肽；淀粉-1,4-葡萄糖苷酶作用于淀粉分子中的α-1,4-糖苷鍵，將淀粉分子分解成成葡萄糖；而脂氧合酶既與類胡蘿卜素、綠素降解有關，又能催化亞油酸、亞麻酸氧化，形成正己醇、己烯酸、己烯醛等香氣成分。

在單一酶試驗研究基礎上，項目組采用響應面分析法開展合理的試驗設計進行試驗，開展不同單一酶復配組合研究，利用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過響應面及軟件運行計算得到最佳組合。在多種酶共同作用下，煙葉中的多肽、蛋白質、粗纖維以及淀粉類大分子有很好的降解轉化作用，這有利于提高煙葉的內在化學成分協調性，從而使煙葉感官質量評分提高，對于提高上部煙葉可用性具體重要意義。

4 結 論

研究結果表明，添加生物酶可以提高上部煙葉質量，對皖南上部煙葉感官質量提升較大的是蛋白酶、淀粉-1,4-葡萄糖苷酶和脂氧合酶，這3種酶對煙葉枯焦氣、辛辣刺激性均有不同程度的改善。

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化確定了最佳復合酶組合，最優組合為蛋白酶1.0‰、淀粉-1,4-葡萄糖0.8‰、脂氧合酶0.12‰，在此條件下感官質量最優得分為22.64分。優化后的復合酶對皖南上部煙葉香氣質提升明顯，刺激性降低，勁頭降低，雜氣減輕，煙氣明顯柔和細膩，質量有明顯提高。上述研究成果對于上部煙葉可用性提升有重要意義。