右美托咪定通過抑制TLR4/NF-κB信號通路促進佐劑性膝骨關節炎大鼠成纖維細胞樣滑膜細胞凋亡*

邢丹丹， 康文越， 王志華， 王 穎， 李 娜， 吳多志， 林 慧

（海南省人民醫院，海南海口570311）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）表現為關節軟骨損傷、滑膜炎癥和滑膜增生，是骨關節炎中常見類型［1］。成纖維細胞樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）作為KOA中參與發病機制的主要細胞，可參與滑膜血管形成、炎癥等過程［2］，特別是其出現的腫瘤樣特征，包括過度增殖和凋亡不足導致滑膜組織異常增生現象［3］，因此促進FLS凋亡成為KOA的潛在治療方法。右美托咪定（dexmedetomi?dine，DEX）作為α2受體激動藥物，具有調控腫瘤細胞增殖和凋亡作用［4］，研究發現在KOA中DEX能夠抑制軟骨細胞凋亡，進而緩解疾病［5］，但在FLS中尚未發現相關研究。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路在KOA中發揮重要作用，不僅可介導促炎癥因子和基質金屬蛋白酶等影響疾病狀態［6］，而且對細胞凋亡和細胞外基質代謝具有重要調控作用［7］，推測TLR4/NF-κB信號通路可能與DEX調控FLS凋亡機制存在一定關系。因此，本研究采用弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant，FCA）建立KOA大鼠模型，探究DEX對FLS凋亡的影響，并探究其機制。

材料和方法

1 動物

SPF級健康SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司，合格證號為SCXK（京）-2016-0011，體重（200±10）g，6~8周齡。溫度（24±1）℃、濕度（50±5）%、12 h光照/12 h黑暗、定期通風環境中自由飲水攝食。實驗符合3R原則，本研究經本院倫理委員會審核并通過。

2 主要試劑

鹽酸DEX注射液（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20090248，規格：2 mL；200μg）；FCA（北京梅科萬德生物科技有限公司，批號：201850231，規格：10 mL）；TLR4激動劑脂多糖（lipo?polysaccharide，LPS；Invivogen，貨號tlrl-b5lps）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（上海生工生物技術公司，貨號E607318）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP原位切口末端標記（terminal deoxy?nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end la?beling，TUNEL）凋亡試劑盒（上海通善生物科技有限公司，貨號Ts-E1001）；抗血管細胞黏附分子1（vas?cular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、TLR4、NF-κB p65、caspase-3、活化的caspase-3（cleaved caspase-3）、核纖層蛋白B（lamin B）和GAPDH抗體（Abcam，貨號分別為ab271899、ab13556、ab207297、ab184787、ab214430、ab16048和ab8245）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測試劑盒和annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，貨號分別為C0037和C1062S）。

3 主要方法

3.1 動物分組及處理 參考文獻［8］建立KOA大鼠模型，大鼠備皮與消毒，剃須刀將大鼠右側前、后膝關節及以下部位毛剃干凈，75%乙醇對剃毛部位消毒，消毒完全后使用注射器將0.1 mL FCA注射液注射入膝關節內，分別在第1、3和7天各注射1次，每天強制大鼠活動1 h，7 d后大鼠膝關節出現紅腫熱痛、同時伴有腫脹現象，周圍出現僵硬，膝關節活動受限則為模型建立成功。模型成功30只，隨機分為模型組（model group）、DEX組（DEX group）、DEX+TLR4激活劑組（DEX+TLR4 activator group），每組10只。對照組（control group）10只大鼠將FCA注射液換為生理鹽水，其余步驟相同。

DEX組鞘內注射100μL/kg DEX［9］，DEX+TLR4激活劑組在DEX組基礎上鞘內注射500μg/kg LPS，對照組、模型組相同部位注射等體積生理鹽水，每天1次，連續28 d。

3.2 KOA嚴重程度的評估及膝關節直徑的測量在建模前和建模后、給藥后均評價關節炎嚴重程度情況。關節炎的嚴重程度分級［10］：無腫脹為0分；關節稍紅腫為1分；關節輕度紅、腫、熱為2分；關節中度紅、腫、熱，出現輕度功能障礙為3分；關節重度紅、腫、熱，活動受限，不能負重為4分。單個膝關節評分在［0，4］分之間，本研究為2個膝關節評估總分（即KOA評估值）。建模前和建模后、給藥后分別用游標卡尺檢測大鼠膝關節直徑。

3.3 HE染色觀察大鼠膝關節滑膜組織的形態 收集各組大鼠膝關節滑膜組織，部分置于4%多聚甲醛中固定48 h，0.5 mol/L脫鈣液EDTA（pH 8.0）脫鈣12 h，經石蠟包埋后切片（厚度5μm），蘇木精染色、伊紅復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察膝關節滑膜組織病理變化（包括病理變化和滑膜增生情況）。

3.4 TUNEL染色檢測膝關節滑膜組織細胞的凋亡情況 使用TUNEL凋亡試劑盒檢測膝關節滑膜組織中細胞凋亡情況。石蠟切片經脫蠟處理，蛋白酶K工作液37℃孵育30 min、DAB顯色液顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。濃縮棕色DAB沉淀的細胞為TUNEL陽性細胞（即凋亡細胞）。隨機選5個視野計數，凋亡指數（%）=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。

3.5 大鼠FLS的分離與培養 方法3.3中剩余部分膝關節滑膜組織立即剔除脂肪和纖維，手術剪剪成1 cm×1 cm×1 cm大小組織塊，用無Ca2+、Mg2+的DHank’s液輕輕漂洗3次，滑膜組織塊平鋪在培養瓶中，置在37℃、5%CO2培養箱中貼壁培養2 h，添加含20%胎牛血清的DMEM培養液，繼續放置在37℃、5%CO2培養箱中貼壁培養。每天觀察，待組織邊緣長出較多細胞后去除組織塊繼續培養，培養期間更換培養液，原代培養細胞成片時傳代，待細胞傳代3代時，光學顯微鏡觀察細胞形態，并采用抗VCAM-1多克隆抗體鑒定培養細胞是否為FLS。

3.6 FLS的鑒定 細胞置6孔板中，95%的冷乙醇固定細胞30 min，滴加VCAM-1多克隆抗體37℃孵育30 min，滴加FITC標記的Ⅱ抗37℃孵育30 min，熒光顯微鏡觀察細胞形態。

3.7 CCK-8法檢測FLS活力 1×107/L FLS接種于96孔板上，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，添加CCK-8試劑，繼續培養2 h，酶標儀在450 nm處檢測細胞的吸光度（A）值。存活率（%）=實驗組（A）值/對照組（A）值×100%。

3.8 Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測FLS的凋亡情況 每組1×108/L FLS，經胰酶消化后500 r/min離心5 min收集細胞置于離心管中，加入400μL annexin V結合液懸浮細胞，再加入5μL annexin VFITC染色液4℃避光孵育15 min，加入10μL PI染色液4℃避光孵育5 min。流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

3.9 Western blot檢測FLS中TLR4、NF-κB p65、cas?pase-3和cleaved caspase-3蛋白水平 細胞漿和細胞核蛋白抽提試劑盒提取細胞漿蛋白和細胞核蛋白（檢測NF-κBp65蛋白水平），其余細胞添加蛋白裂解液冰上裂解10 min，10 000 r/min離心10 min，上清為總蛋白（檢測其余蛋白水平）。凝膠電泳分離蛋白、PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，分別添加對應抗TLR4、NF-κB p65、caspase-3、cleaved caspase-3、lamin B（細胞核蛋白內參照）和GAPDH（其余蛋白內參照）抗體，4℃孵育過夜；加入對應Ⅱ抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像儀（Tanon，型號：3500）拍照和定量分析。

4 統計學處理

GraphPad Prism 7.0軟件對所有數據進行分析。計量數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DEX對大鼠KOA的影響

建模前，各組KOA評估值和膝關節直徑差異無統計學顯著性（P>0.05）。建模后，與對照組相比，模型組、DEX組和DEX+TLR4激活劑組KOA評估值、膝關節直徑升高（P<0.05）。給藥后，與對照組相比，模型組、DEX+TLR4激活劑組KOA評估值和膝關節直徑及DEX組KOA評估值升高（P<0.05）；與模型組相比，DEX組KOA評估值和膝關節直徑及DEX+TLR4激活劑組KOA評估值降低（P<0.05）；與DEX組相比，DEX+TLR4激活劑組KOA評估值和膝關節直徑升高（P<0.05）。見表1。

表1 4組大鼠KOA評估值和膝關節直徑的比較Table 1.Comparison of KOA evaluation value and knee joint diameter in the 4 groups（Mean±SD.n=10）

2 DEX對大鼠膝關節滑膜組織形態的影響

對照組滑膜組織、滑膜內膜各層次完整，整齊排列；模型組出現大量炎癥細胞浸潤現象，纖維組織增生、滑膜細胞增生明顯，各層次排列紊亂，滑膜組織周圍出現較多毛細血管增生現象，呈重度滑膜炎現象；DEX組出現輕度炎癥浸潤現象，纖維組織、滑膜細胞存在部分增生，排列規則，滑膜組織周圍出現微量毛細血管增生現象，呈輕度滑膜炎現象；DEX+TLR4激活劑組呈中度滑膜炎現象。見圖1。

Figure 1.Histological changes of knee synovium in the 4 groups（HEstaining，×200）.圖1 4組大鼠膝關節滑膜組織形態

3 DEX對大鼠膝關節滑膜組織細胞凋亡的影響

分別與對照組和模型組相比，DEX組和DEX+TLR4激活劑組膝關節滑膜組織細胞凋亡指數升高（P<0.05）；與DEX組相比，DEX+TLR4激活劑組膝關節滑膜組織細胞凋亡指數降低（P<0.05）。見圖2、表2。

4 大鼠FLS的鑒定結果

各組細胞分離培養發現，細胞均呈紡錘形，與FLS形態基本一致。免疫熒光細胞化學分析顯示，VCAM-1呈陽性表達，即培養細胞為FLS。見圖3。

Figure 2.Apoptosis of synovial cells in the knee joint of rats in the 4 groups（TUNEL staining，×200）.圖2 4組大鼠膝關節滑膜組織細胞凋亡情況

Figure 3.The morphological changes of FLS（×100）and the expression of its marker protein VCAM-1（cytoimmunofluorescence staining，×200）.圖3 FLS的形態及標志蛋白VCAM-1的表達

5 DEX對FLS活力的影響

與對照組相比，模型組、DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS的活力升高（P<0.05）；與模型組相比，DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS活力降低（P<0.05）；與DEX組相比，DEX+TLR4激活劑組FLS活力升高（P<0.05）。見表2。

6 DEX對FLS凋亡的影響

分別與對照組和模型組相比，DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS的凋亡率升高（P<0.05）；與DEX組相比，DEX+TLR4激活劑組FLS的凋亡率降低（P<0.05）。見圖4、表2。

表2 4組大鼠膝關節滑膜組織細胞凋亡指數（TUNEL染色）、FLS活力和FLS凋亡率（流式細胞術）的比較Table 2.Comparisons of apoptotic index of synovial tissue cells in knee joint（by TUNEL staining），the viability of FLS，and the apoptotic index of FLS（by flow cytometry）in the 4 groups（%.Mean±SD.n=10）

Figure 4.The representitive images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of FLSin 4 groups.圖4 4組FLS凋亡情況的流式細胞術圖像

7 DEX對FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的影響

與對照組相比，DEX組、DEX+TLR4激活劑組FLS中TLR4、cleaved caspase-3/caspase-3及核內NF-κB p65蛋白水平，模型組FLS中TLR4和核內NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05），模型組、DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS中核外NF-κB p65蛋白水平降低（P<0.05）；與模型組相比，DEX組和DEX+TLR4激活劑組FLS中TLR4和核內NF-κB p65蛋白水平降低（P<0.05），cleaved caspase-3/caspase-3和核外NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05）；與DEX組相比，DEX+TLR4激活劑組FLS中TLR4和核內NF-κB p65蛋白水平升高（P<0.05），cleaved caspase-3/cas?pase-3和核外NF-κB p65蛋白水平降低（P<0.05）。見圖5、表3。

表3 4組FLS中TLR4、NF-4a p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平的比較Table 3.Comparisons of TLR4，NF-κB p65，caspase-3 and cleaved caspase-3 protein levels in FLSof the 4 groups（Mean±SD.n=10）

Figure 5.The images of Western blot for determining the protein levels of TLR4，NF-κB p65，caspase-3 and cleaved caspase-3 in FLSof the 4 groups.圖5 4組FLS中TLR4、NF-κB p65、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白水平變化的比較

討 論

KOA中FLS增殖過度、凋亡不足，滑膜組織增生，表現為FLS類腫瘤樣會導致關節局部結構破壞［11］。誘導FLS凋亡能夠降低滑膜組織的異常增生，實現對疾病的緩解。DEX在KOA治療中常作為麻醉藥物，用于緩解術后鎮痛［12］；隨著研究深入，研究發現DEX能夠影響細胞凋亡從而影響疾病，為DEX在KOA臨床上的應用提供新的理論依據。在本研究中，KOA大鼠評估值升高、膝關節直徑增加，膝關節腫脹明顯，組織病理切片發現滑膜組織表現出炎癥浸潤明顯、滑膜細胞增生現象明顯，各層次紊亂嚴重，表現出重度滑膜炎現象，提示KOA中滑膜組織損傷嚴重。經DEX治療后，KOA大鼠膝關節滑膜組織病理損傷減輕明顯，僅出現輕度炎癥浸潤現象，纖維組織、滑膜細胞存在部分增生，提示DEX能夠緩解滑膜細胞過度增生現象，實現對KOA大鼠的保護。進一步TUNEL染色發現DEX治療后滑膜組織細胞凋亡指數升高，提示DEX可能是通過促進細胞凋亡從而緩解KOA中滑膜細胞的過度生長現象，具體機制尚需進一步研究。

滑膜細胞分為A型滑膜細胞（巨噬細胞樣滑膜細胞）和B型滑膜細胞（FLS），在KOA中以FLS為主，約占70%~80%。為驗證KOA中FLS發揮的作用，本文提取原代FLS，又因VCAM-1作為FLS分子標記之一，在FLS中大量表達，而在其它成纖維細胞中不表達［13］，因此本研究采用免疫熒光細胞化學染色鑒定FLS，研究發現，細胞呈紡錘形，且VCAM-1呈陽性表達，即提取細胞為FLS，可用于接下來研究。本研究發現，FLS在KOA中生長加快、凋亡差異不明顯，提示FLS的異常生長卻不凋亡是滑膜組織異常增生的原因之一。

在KOA模型大鼠FLS中TLR4、核內NF-κB p65蛋白水平明顯升高，核外NF-κBp65蛋白水平明顯降低，提示TLR4/NF-κB在KOA大鼠FLS異常生長中發揮一定作用。而TLR4作為機體重要蛋白質免疫分子，可調控多種非特異性免疫，在KOA中既可以激活機體免疫細胞應答并誘導激發抗微生物防御系統，產生更多炎癥因子，炎癥因子在NF-κB p65作用下參與疾病免疫過程［14］；又可以影響細胞凋亡，從而影響疾病［15］，在KOA中抑制TLR4的表達能夠緩解疾病，實現對滑膜細胞異常增生的緩解［16］。NF-κB p65作為廣泛存在于哺乳動物細胞中的轉錄因子，參與多種基因調控過程，作為TLR4下游調控因子，能夠由胞質轉位到核內，刺激各種細胞因子等的表達［17］。TLR4/NF-κB通路與細胞凋亡關系密切，荔枝核總黃酮在大鼠肝星狀細胞中抑制細胞增殖、促進細胞凋亡與抑制TLR4/NF-κB通路激活關系密切［18］。caspase-3作為促凋亡因子，在KOA中研究發現，抑制凋亡相關蛋白caspase-1和caspase-3等的活化可抑制KOA的發生［19］。此外，DEX能夠抑制炎癥通路TLR4/NF-κB的表達，實現對KOA的緩解［20］。在本研究中，經DEX治療后KOA大鼠FLS存活率及細胞中TLR4、核內NF-κBp65蛋白水平降低，凋亡率及細胞中核外NF-κB p65、cleaved caspase-3蛋白水平升高；在DEX基礎上添加TLR4激活劑LPS后，大鼠膝關節滑膜組織炎癥浸潤程度加重，且滑膜組織細胞凋亡指數及FLS凋亡率降低，提示DEX抑制TLR4/NF-κB的表達從而促進FLS細胞凋亡，實現對疾病的緩解。

綜上所述，DEX通過下調TLR4表達、抑制NF-κB核移位從而促進KOA中FLS凋亡，從而緩解滑膜組織異常增生，實現對疾病的保護，為DEX在KOA中應用提供新的依據。TLR4/NF-κB通路與炎癥關系密切，但在本研究中尚未做炎癥相關的探討，接下來這將作為研究重點深入探究。