LncRNA TMPO-AS1調控miR-143-3p的表達影響肺癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡

周斌鋒 彭兵鋒 王志強 喻國平 張小強

(1鷹潭市人民醫院心胸外科，江西 鷹潭 335000；2南昌大學附屬第二醫院胸外科)

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，據調查研究顯示全世界范圍內肺癌發病率持續升高，其中非小細胞肺癌是肺癌的主要病理類型，目前臨床常采用手術、化療等手段治療肺癌，但肺癌患者生存率仍未明顯升高〔1〕。近年來，免疫治療與分子靶向治療成為研究熱點，因而深入探究肺癌發生的分子生物過程有助于尋找新的治療靶點以此提高患者生存率。長鏈非編碼RNA(LncRNA)TMPO-AS1可促進非小細胞肺癌、前列腺癌等腫瘤發生及發展〔2，3〕。但TMPO-AS1在肺癌發生及發展過程中的分子機制尚未完全闡明。LncBase v.2網站預測顯示微小RNA-143-3p(miR-143-3p)可能是TMPO-AS1的靶基因，研究表明miR-143-3p在結腸癌、宮頸癌、喉部鱗狀細胞癌等惡性腫瘤中均呈低表達，上調其表達可抑制腫瘤細胞增殖及轉移〔4～8〕。但TMPO-AS1是否可通過靶向miR-143-3p促進肺癌發生及發展尚未可知。因此，本研究主要探討TMPO-AS1與miR-143-3p在肺癌細胞中的相互作用關系，初步分析其對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響，為肺癌靶向治療提供潛在靶點。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 BEAS-2B、肺癌細胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9均購自美國ATCC細胞庫。DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；TMPO-AS1小干擾RNA(si-TMPO-AS1)、si-con、miR-143-3p mimics、miR-con、miR-143-3p抑制劑(anti-miR-143-3p)、anti-miR-con均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；pcDNA3.1購自北京合生基因科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；MTT細胞增殖試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；Trizol、反轉錄及qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；兔抗人PCNA、基質金屬蛋白酶(MMP)-2多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗體購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞轉染及分組 BEAS-2B細胞與肺癌細胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9均培養于含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞生長至80%左右時進行傳代培養，取對數生長期肺癌SPC-A-1、H446細胞，0.25%胰蛋白酶消化細胞，制備細胞懸液，接種于6孔板，置于37℃、5%CO2培養箱內繼續培養，待細胞生長融合至50%時，參照Lipofectamine2000試劑說明書進行轉染，轉染前更換為Opti-MEM減血清培養基，實驗將肺癌SPC-A-1、H446細胞隨機分為si-con組(si-con分別轉染入SPC-A-1、H446細胞)、si-TMPO-AS1組(si-TMPO-AS1分別轉染入SPC-A-1、H446細胞)、miR-con組(miR-con分別轉染入SPC-A-1、H446細胞)、miR-143-3p組(miR-143-3p mimics分別轉染入SPC-A-1、H446細胞)、si-TMPO-AS1 +anti-miR-con組(si-TMPO-AS1與anti-miR-con分別共轉染入SPC-A-1、H446細胞)、si-TMPO-AS1 +anti-miR-143-3p組(si-TMPO-AS1 與anti-miR-143-3p分別共轉染入SPC-A-1、H446細胞)，各組細胞轉染6 h后更換為含有10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素混合溶液的DMEM培養基繼續培養48 h，收集對數生長期細胞進行后續功能驗證。

1.2.2qRT-PCR檢測細胞中TMPO-AS1、miR-143-3p表達水平 采用Trizol法提取細胞總RNA，應用NanoDrop2000分光光度計檢測RNA濃度，取2μg RNA參照反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄為cDNA，qRT-PCR檢測TMPO-AS1、miR-143-3p的表達水平，反應體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O補足體系至20 μl；反應條件：95℃ 2 min(循環1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環40次)，檢測miR-143-3p表達時以U6為內參，TMPO-AS1以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算TMPO-AS1、miR-143-3p相對表達量。

1.2.3噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 轉染后各組肺癌SPC-A-1、H446細胞按照每孔5 ×103個細胞的密度接種于96孔板，同時設置空白孔(培養液、無細胞)，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入150 μl DMSO，低速振蕩，充分混勻，應用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度值(OD)，計算細胞存活率，細胞存活率(%)=〔(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(正常培養組OD值-空白對照OD值)〕×100%。

1.2.4克隆形成實驗 收集各組肺癌SPC-A-1、H446細胞，用胰蛋白酶消化細胞，4℃，1 000 r/min轉速離心3 min(離心半徑12 cm)，棄上清，加入無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)5 ml，洗滌細胞沉淀，相同條件下再次離心，反復洗滌3次，加入培養基，制備單細胞懸液，調整細胞濃度為1×103個/ml，單細胞懸液接種于6孔板進行克隆形成培養，每3 d更換一次培養，繼續培養14 d后觀察細胞克隆形成情況，實驗設置3次重復。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 分別收集各組肺癌SPC-A-1、H446細胞，胰蛋白酶消化細胞，4℃，1 000 r/min轉速離心5 min，棄上清，加入預冷PBS洗滌2次，每次5 min，棄上清，渦旋振蕩30 s，制備細胞懸浮液，加入200 μl結合緩沖液，再加入10 μl Annexin V-FITC。振蕩混勻，冰上避光孵育30 min，加入5 μl PI，渦旋振蕩混勻，冰上孵育5 min，加入400 μl結合緩沖液，渦旋振蕩混勻，使用300目尼龍網過濾，于1 h內應用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞遷移及侵襲 細胞侵襲實驗：肺癌SPC-A-1、H446細胞培養于含有0.1%胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后，用不含胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，取2×105個細胞接種于含有基質膠的Transwell小室上室中(直徑6.5 μm，孔徑8 μm)，取500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培養基置于Transwell小室的下腔中，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱機修培養24 h，去除上膜表面上的細胞，用多聚甲醛固定20 min，0.5%結晶紫染色液染色10 min，無菌水清洗后置于倒置顯微鏡下隨機選取10個視野計數。細胞遷移實驗：用不含胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，取2×105個細胞接種于Transwell小室上室中，其余實驗步驟同細胞侵襲實驗，實驗均設置3次生物學重復。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測 構建TMPO-AS1攜帶的3′UTR的熒光素酶報告因子，每個基因的結合位點與miR-143-3p結合位點相對應，熒光素酶測定顯示TMPO-AS1與miR-143-3p存在結合位點，將結合位點與突變位點分別載入熒光素酶報告基因載體，分別為野生型WT-TMPO-AS1、突變型MUT-TMPO-AS1，WT-TMPO-AS1、MUT-TMPO-AS1分別與miR-143-3p mimics、miR-con分別共轉染入肺癌SPC-A-1、H446細胞，繼續培養24 h，應用雙熒光素酶報告基因測定系統檢測熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.8Western印跡檢測PCNA、MMP-2、酶切caspase-3蛋白表達 分別取各組肺癌SPC-A-1、H446細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min轉速離心10 min(離心半徑6 cm)提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白煮沸變性，取變性完成蛋白樣品30 μg/孔加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的加樣孔內，經SDS-PAGE分離蛋白，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃輕搖24 h，TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，避光加入ECL顯色液，曝光，顯影，凝膠分析系統及ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.3統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1TMPO-AS1和 miR-143-3p在肺癌細胞中的表達 與BEAS-2B相比，肺癌細胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9中TMPO-AS1的表達水平均顯著升高(P<0.05)，而肺癌細胞A549、SPC-A-1、H446、PC-9中 miR-143-3p的表達水平均顯著降低(P<0.05)，見表1。其中肺癌SPC-A-1、H446細胞中TMPO-AS1的表達水平相比于其他肺癌細胞系明顯升高(均P<0.05)，因而本研究選取肺癌SPC-A-1、H446細胞進行后續實驗。

表1 檢測肺癌細胞中TMPO-AS1和 miR-143-3p表達

2.2沉默TMPO-AS1或過表達 miR-143-3p對肺癌細胞增殖的影響 與si-con組相比，si-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細胞存活率及克隆形成率顯著降低(P<0.05)，PCNA蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)；相較于miR-con組，miR-143-3p組肺癌SPC-A-1、H446細胞存活率、克隆形成率與PCNA蛋白的表達水平均顯著下降(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 檢測肺癌細胞中PCNA蛋白表達

2.3沉默TMPO-AS1或過表達 miR-143-3p對肺癌細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，si-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細胞凋亡率均顯著高于si-con組(均P<0.05)，酶切caspase-3表達水平均顯著升高(均P<0.05)；相較于miR-con組，miR-143-3p組肺癌SPC-A-1、H446細胞凋亡數顯著增多(均P<0.05)，酶切caspase-3的表達均上調(均P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡和Western印跡檢測肺癌細胞中酶切caspase-3蛋白表達

2.4沉默TMPO-AS1或過表達 miR-143-3p對肺癌細胞遷移和侵襲的影響 肺癌SPC-A-1、H446細胞中沉默TMPO-AS1或 miR-143-3p過表達后，與si-con組比較，si-TMPO-AS1組細胞遷移及侵襲均數顯著減少(均P<0.05)，MMP-2蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)；與miR-con組比較，miR-143-3p組細胞遷移及侵襲數顯著減少(P<0.05)，MMP-2蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖3、圖4、表4。

圖3 Transwell檢測肺癌細胞遷移和侵襲(結晶紫染色，×200)

圖4 Western印跡檢測各組MMP-2表達

2.5TMPO-AS1靶向調控 miR-143-3p的表達 LncBase v.2網站預測顯示TMPO-AS1與 miR-143-3p存在互補靶向序列，見圖5。雙熒光素酶報告實驗結果顯示，肺癌SPC-A-1、H446細胞中轉染克隆有TMPO-AS1-3′UTR突變型載體質粒實驗中，miR-143-3p組與miR-con組比較，熒光素酶活性差異無顯著性；轉染克隆有TMPO-AS1-3′UTR載體質粒實驗中，miR-143-3p組熒光素酶活性明顯受到抑制，與miR-con組比較，熒光素酶活性差異具有顯著性(P<0.05)，見表5。

圖5 TMPO-AS1與 miR-143-3p存在互補靶向序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

qRT-PCR檢測結果顯示，si-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細胞中miR-143-3p的表達水平顯著高于si-con組，差異有統計學意義(P<0.05)，pcDNA-TMPO-AS1組肺癌SPC-A-1、H446細胞中miR-143-3p的表達水平顯著低于pcDNA組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 LncRNA TMPO-AS1調控 miR-143-3p的表達

2.6干擾 miR-143-3p表達逆轉沉默TMPO-AS1對肺癌細胞的抑制作用 相較于si-TMPO-AS1+anti-miR-con組，si-TMPO-AS1+anti-miR-143-3p組肺癌SPC-A-1、H446細胞存活率與克隆形成率均顯著升高，差異有統計學意義(均P<0.05)，遷移細胞數與侵襲細胞數均顯著增加，差異有統計學意義(均P<0.05)，細胞凋亡率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，PCNA、MMP-2蛋白的表達水平均顯著升高，差異有統計學意義(均P<0.05)，而酶切caspase-3蛋白的表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖6、表7、表8。

1～4：si-con組、si-TMPO-AS1組、si-TMPOAS1+anti-miR-con組、si-TMPOAS1+anti-miR-143-3p組圖6 Western印跡檢測肺癌細胞中酶切caspase-3、PCNA和MMP-2蛋白表達

3 討 論

大部分肺癌患者確診時已處于中晚期，經臨床治療后患者預后較差〔9〕。因而急需尋找早期診斷及監測肺癌的新方法。研究表明LncRNA可能通過調控miRNA而參與肺癌發生及發展過程〔10，11〕。但仍有部分LncRNA-miRNA在肺癌發生過程中的作用機制尚未完全闡明。本研究深入分析TMPO-AS1與miR-143-3p在肺癌發生發展過程中的可能作用機制。

TMPO-AS1在肺腺癌患者血清中呈高表達，其高表達量與患者預后不良密切相關，研究表明TMPO-AS1還可能競爭性吸附miRNA而參與肺腺癌發生發展過程〔12，13〕。本研究結果提示TMPO-AS1表達水平升高可能促進肺癌的發生，沉默TMPO-AS1表達可顯著降低肺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，誘導細胞凋亡。研究表明PCNA可反映腫瘤細胞增殖，其表達水平升高預示細胞增殖能力增強，MMP-2過表達可增強腫瘤細胞遷移及侵襲能力，酶切caspase-3蛋白是細胞凋亡發生過程中的關鍵因子，其表達量升高預示凋亡細胞數增加〔14～16〕。本研究結果提示沉默TMPO-AS1表達可通過上調Cleaved caspase-3蛋白表達及下調PCNA、MMP-2蛋白表達而促進肺癌細胞凋亡，抑制細胞增殖、遷移及侵襲。

miR-143-3p在乳腺癌細胞中呈低表達，miR-143-3p過表達可通過靶向LIM結構域激酶1的表達而抑制乳腺癌發生及發展〔17〕。研究表明miR-142-3p通過靶向CDC25C，TGFβR1，GNAQ，WASL、RAC1抑制黑色素瘤惡性進展〔18〕。與上述研究結果相似，本研究結果表明miR-143-3p在肺癌細胞中的表達水平顯著降低，miR-143-3p過表達與沉默TMPO-AS1后對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的作用效果相同，同時本研究通過雙熒光素酶報告實驗及qRT-PCR實驗證明TMPO-AS1可靶向負性調控miR-143-3p的表達，提示TMPO-AS1可能靶向抑制miR-143-3p表達而促進肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，抑制細胞凋亡。本研究結果提示沉默TMPO-AS1表達可通過上調miR-143-3p表達而減弱肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，促進細胞凋亡。

綜上，TMPO-AS1可調控miR-143-3p的表達影響肺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡，為揭示肺癌發生的分子機制奠定理論基礎，可為肺癌的靶向治療提供新的靶點。