一株秸稈纖維素降解菌株的篩選及其降解特性

吳 潔，楊 梅

(吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022)

吉林省的玉米秸稈纖維素資源非常可觀，然而很大一部分的秸稈沒有得到合理化的利用，反而被大量的棄置、焚燒.進而引發很嚴重的高消耗、高污染、低產出的狀況.如今，怎樣實現可再生植物纖維資源的高效利用與轉化，對于我國的能源、環境以及循環經濟的實現是一個重大的機遇和轉折點[1].因此將纖維素水解成葡萄糖等物質，繼而應用到食品制造、飼料加工、酒精發酵等眾多領域，使纖維素可以得到重復利用，對緩解人類能源緊缺以及環境污染等問題具有重要意義.

秸稈中的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，目前較為常見的纖維素降解方法為物理、化學、生物降解這3個方面.微生物降解處理纖維素是一種相對更為安全、無公害的方法，也是目前國內外的研究熱點[2].利用微生物生產纖維素酶普遍存在活力低、成本高等問題，制約著纖維素資源利用的進一步發展.因此，開發纖維素酶高產菌種并加強菌株選育等基礎研究，是纖維素資源高效利用的關鍵所在.本文從多年種植玉米地土壤中分離出1株高效纖維素降解菌，該菌命名為J-N3,并初步考察其酶學性質以及秸稈的降解效果.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 樣品來源

土壤樣品采集：吉林市郊區多年種植玉米田地，去除表層土5 cm，取距地表5～10 cm的土壤樣品，置于無菌袋中.將樣品帶回實驗室，后過40目篩，置于4 ℃冰箱保存.

1.1.2 培養基

PDA液體(固體)培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL，自然pH.

富集培養基：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5.0 g、秸稈粉 5.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO40.5 g、(NH4)2SO42.0 g、NaCl 0.5 g、牛肉膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH自然.

羧甲基纖維素鈉培養基：分別稱取羧甲基纖維素鈉15 g、NaCl 0.5 g、蛋白胨2 g、MgSO40.5 g、K2HPO41 g、酵母膏0.5 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.0.

赫奇遜(Hutchison)無機鹽培養基(g·L-1) ：KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5、FeCl30.01、CaCl20.01、瓊脂粉18 g，pH 7.2左右.

發酵培養基：KH2PO41.0 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaNO32.5 g、FeCl30.01 g、CaCl20.1 g、玉米秸稈粉20 g，pH 7.0.

1.1.3 主要儀器

滅菌鍋滅菌鍋(YXQ-LS上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；干燥箱(DHG-9240A上海一恒科技有限公司)；無菌操作臺(JHL-1500北京萊博特瑞科技有限公司)；紫外可見分光光度計(UV2600貴州賽蘭博科學儀器有限責任公司)；恒溫振蕩器(HZQ-X300上海一恒科學儀器有限公司)；生化培養箱LRH-70/70F上海一恒科學儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離篩選

稱取1 g土樣置于含有100 mL富集培養基的三角瓶中,并放入玻璃珠充分打散混勻,在30 ℃、150 r/min條件下在恒溫振蕩培養箱中培養3 d，將純化后的菌株，用接種環挑取單菌落，于羧甲基纖維素(CMC)固體培養基平板上點種3個點，放入恒溫培養箱中30 ℃倒置培養3 d[3].等待菌落長出，此時用1 mg·mL-1剛果紅染液對其進行染色30 min，之后棄掉所用剛果紅染液，其次吸取1 mol·L-1NaCl溶液進行脫色30 min.稍后呈現出明顯的透明圈，測其透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)大小，選取D/d值較大(D/d值越大，產酶能力越強)的進行復篩.

1.2.2 濾紙降解實驗

將上述實驗所得菌株，置于液體培養基中以30 ℃，150 r/min于恒溫震蕩培養箱中培養制備菌液[4].在100 mL赫奇遜無機鹽培養基中加入1 cm×6 cm的濾紙條，接入5 mL菌液之后進行恒溫震蕩，為避免震蕩導致濾紙斷裂，同時滿足該菌株生長所需的有氧條件，本實驗采用的搖床轉速為80 r/min，培養20 d，觀察濾紙條的斷裂情況判斷降解效果[5-6].

1.2.3 纖維素酶活測定

粗酶液的制備：將初篩得到的單菌株制成菌懸液，以5%的接種量接種到液體產酶培養基中，35 ℃，150 r/min搖床中培養.在8 000 r/min條件下，將培養液離心10 min，取其上清液作為粗酶液.

CMCase活力的測定[7]：取0.5 mL 稀釋的酶液和1.5 mL的1%CMC-Na溶液，放入50 ℃恒溫水浴中反應30 min,加入3.0 mL的DNS 試劑，沸水浴10 min,冷卻后定容至25.0 mL.在540 nm處測OD值,并根據葡萄糖標準曲線,求出酶解所得葡萄糖含量,換算成酶活力值.

濾紙酶活力的測定[8]：取新華濾紙50 mg放入試管中,加入 0.5 mL粗酶液和1.5 mL檸檬酸緩沖液,在 50 ℃恒溫水浴中反應30 min,加入3.0 mL DNS溶液,沸水浴10 min,冷卻后定容至25.0 mL.在540 nm處測OD值,根據葡萄糖標準曲線求出酶活力值.

1.2.4 秸稈降解率測定

接種篩選菌株到液體發酵培養基中制備菌液，按接種量5%制備好的菌液到含有秸稈的液體發酵培養基中，進行恒溫震蕩培養[9].秸稈降解過程中，于5、10、15、20 d 取各組秸稈并用自來水清洗干凈后，置于 85 ℃烘箱中烘干至恒重，用減重法測定秸稈失重率，同時，每組分別取秸稈粉(將秸稈粉碎后過40目篩)1 g，按照Van Soest 法[10]測定秸稈降解過程中纖維素分解率.

1.2.5 菌株鑒定

觀察菌落及菌體形態特征，參照《真菌鑒定手冊》[11]和《中國真菌志》[12]對菌株進行形態學鑒定.

分子生物學鑒定提取細菌基因組總DNA，擴增16S rDNA和5.8S rDNA之間的保守序列，PCR引物為27F：(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)，1492R：(TACGGYTACCTTGTTACGACTT).PCR反應體系為 25 μL，反應條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；循環30次；72 ℃ 10 min.擴增產物測序,進行比較分析.

2 結果與討論

2.1 菌株的分離篩選

將有分解纖維素能力的菌株和篩選到菌株點接于鑒別培養基培養，經0.1%剛果紅染色和1 mol·L-1NaCl 溶液脫色后，有4個菌株形成的透明降解圈較大.隨后,對這4個菌株進行濾紙降解實驗，其結果如表1所示.最后對其進行液體發酵培養并測定其發酵上清液酶活，見表2.其中，菌株J-N3發酵上清液的羧甲基纖維素酶酶活為64.92±0.11 U·mL-1，FPA為39.75±0.10 U·mL-1，其中第3種酶活力較其他3個菌株高，故以此菌株為研究對象開展后續試驗.

表1 剛果紅染色實驗結果

表2 各菌株發酵上清液纖維素酶酶活

2.2 菌株的鑒定

菌落較大，顏色呈現灰白且略帶些黃色，其表面粗糙且無規則，并伴有隆起、皺褶等，如圖1所示.

圖1 菌株J-N3菌落形態特征

僅通過對菌落的形態觀察尚不能確定菌株的具體種屬，還需通過分子生物學方法進行進一步 鑒定.提取菌株J-N3的基因組DNA進行PCR擴增并測序，測得其ITS序列長度為531bp，于NCBI 數據庫進行 BLAST 比對后發現，ITS 序列與J-N3相似性最高的菌株屬于芽孢桿菌，如表3所示.

表3 纖維素降解菌株的相似菌種及相似度

2.3 菌株J-N3所產纖維素酶的測定結果

2.3.1 培養時間對酶活力的影響

取活化后的菌種，按5%接種量于250 mL液體產酶培養基，35 ℃、150 rmp震蕩培養7 d，每培養24 h取樣1次，連續測定纖維素酶活力，如圖2研究培養時間對菌株發酵液酶活力的影響.

t/d圖2 時間對酶活的影響

2.3.2 酶的最適反應pH

在50 ℃條件下，分別在pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液體系中，測定該纖維素酶活力.由圖3可知，該纖維素酶的最適反應pH為6.0.在pH 4.0～6.0之間，纖維素酶活力逐漸升高；在pH 6.0～8.0之間，纖維素酶活力有小幅降低.

pH圖3 pH對酶活的影響

2.3.3 酶的最適反應溫度

在pH 6.0體系中，分別在30、40、50、60、70、80 ℃下，測定該纖維素酶活力.由圖4可知，該酶的最適反應溫度為50 ℃；其對溫度的適應性較強，在 30～50 ℃之間，酶活力都維持在較高增長水平；當溫度高于 50 ℃ 時，纖維素酶活力迅速下降.

T/℃圖4 溫度對酶活的影響

2.4 菌株J-N3對玉米秸稈的降解效果

對同一取樣時間段的數據進行分析，20 d 時，菌株J-N3處理組秸稈失重率為26.22%，每組取秸稈粉1 g，用于測定秸稈中的纖維素含量，并計算纖維素分解率，此時菌株處理組纖維素分解率達到31.01%.綜合玉米秸稈失重率和纖維素分解率的測定結果，表明菌株對玉米秸稈具有良好的降解功能.

3 結 論

近年來對纖維素降解菌的研究越來越關注，農作物秸稈是自然界中最豐富的可再生資源，如何有效利用秸稈纖維素是普遍關注的研究熱點.本研究篩選獲得 1 株高產纖維素酶的菌株J-N3.結合形態學特征與分子生物學鑒定結果可知，菌株 J-N3為芽孢桿菌屬.并對其所產纖維素酶的酶學性質進行了初步研究，該酶在發酵第3 d時CMC酶活最高，最適反應pH為 6.0，最適反應溫度為50 ℃，并且菌株對玉米秸稈具有良好的降解功能.玉米秸稈經菌株 J-N3處理20d 時，秸稈失重率及纖維素分解率分別達到26.22%和31.01%.