茂名地區嬰幼兒G6PD缺乏癥基因突變分析

陳紅玲 譚滿勝 謝清豐 聶俊瑋 劉沃滿

【關鍵詞】葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶缺乏癥;基因突變;熒光PCR 熔解曲線法;流行病學調查

葡萄糖- 6 - 磷酸脫氫酶（ G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t edehydrogenase， G6PD） 缺乏癥俗稱蠶豆病，指的是紅細胞葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶活性降低和（ 或） 酶性質改變導致以溶血為主要表現的一種X 連鎖隱性或不完全顯性遺傳性疾病[1]。我國是G6PD缺乏癥的高發區，由南至北發病率逐漸降低，以廣東、廣西、海南、貴州和臺灣等地區發病率較高[2]。G6PD 缺乏癥的臨床表現差異很大，多數為無癥狀者，部分患者表現為慢性溶血性貧血癥狀[3]。較嚴重者的表現為新生兒期重癥核黃疸，可造成死亡或神經系統永久性損傷[4]。G6PD 缺乏癥一旦發病可導致嚴重后果且尚無有效的根治方法，因此，及早地篩查與基因診斷以便采取有效的預防措施和控制誘因，是減少G6PD缺乏癥發生最有效的措施[5]。茂名地處廣東省西部，是G6PD缺乏癥的高發地區，據陳海玲等對茂名地區344763份新生兒血樣本進行遺傳代謝病篩查結果分析指出G6PD缺乏癥發生率高達7.41%[6]。以往本地區對于G6PD 缺乏癥的相關研究主要以酶的活性檢測為主，涉及基因檢測的報道少見。本研究采用熒光PCR熔解曲線法對嬰幼兒外周血進行基因檢測，探討茂名地區G6PD基因突變的類型和分布特點，為本地區流行病學調查、臨床上診斷和預防G6PD缺乏癥提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 對象 從2018 年1 月至2019 年12 月因G6PD 活性檢測陽性而召回茂名市婦幼保健院復診的嬰幼兒中抽取326 例進行G6PD 缺乏癥基因突變檢測，其中男性264 例、女性62例，年齡11 d ～3 歲?；虻臋z測均對嬰幼兒的法定監護人進行知情告知并簽署同意書。

1.2儀器和試劑 ①儀器：實驗中用到的儀器設備有：廈門致善Lab-Aid 820核酸提取儀、賽默飛世爾BIOMATE 3S紫外分光光度計和美國伯樂CFX-96熒光定量PCR儀。②試劑：Lab-Aid 820核酸提取Mini試劑和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變檢測試劑均來源于廈門致善生物科技股份有限公司。

1.3 方法 ①樣本采集：抽取上述患兒靜脈血1 mL 于EDTA 抗凝管中送檢，暫未檢測標本置于4℃～8℃保存不超過一周。②試劑的準備：在試劑準備區將PCR 反應液A 和B按要求配制并分裝于PCR 薄壁反應管。將配制好的PCR 反應管轉移至標本制備區，貯存于-18℃以下直至樣本DNA提取完。③ DNA 的提取及加樣 用Lab-Aid 820 核酸提取儀提取樣本的DNA，用BIOMATE 3S 紫外分光光度計測定提取的DNA 樣本的濃度和純度，DNA 樣本的OD260nm/OD280nm 均在1.6-2.0 范圍之間，且OD260nm/OD230nm ≥ 2.0。按試劑盒說明書加樣，蓋上管蓋，瞬時離心后轉移至PCR 擴增區。④ PCR擴增、溶解曲線的分析和結果的判讀 在具有FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道多色熔解曲線分析功能的BIO-RAD CFX96PCR 擴增儀上設置PCR 反應程序為：50℃ 2 min → 95℃ 10min → （95℃ 15 s → 65℃-56℃（ 每個循環下降1℃）15 s → 76℃20 s）×10 個循環→ （95℃ 15 s→ 55℃ 15 s→ 76℃ 20 s）×50 個循環→ 95℃1 min → 35℃ 3 min → 40℃-85℃以0.4℃/5 s 的升溫速率進行熔解曲線分析，且在此階段采集FAM、HEX、ROX 和Cy5 通道熒光信號。結果的判讀通過比較待測樣本在A 和B 體系中共八個檢測通道的熔解峰與野生型對照對應通道的熔解峰之間熔點（Tm 值） 的差異判斷樣本是否發生突變，當樣本熔解峰與野生型對照對應熔解峰差異（ΔTm 值）在±1℃以內的即為野生型峰，差異超過±2℃的即為突變型峰[7]。本次檢測中國人群常見的12 種G6PD 基因突變的類型及各突變型在對應通道的ΔTm值波動范圍見表1。

2 結果

對茂名地區G6PD 活性篩查陽性召回的326 例嬰幼兒（ 男性264 例，女性62 例），采用熒光PCR 熔解曲線法進行基因突變檢測，共檢出基因突變301 例（ 男性249 例，女性52 例），基因突變率92.33%。在301 例突變樣本中檢出10 種單一突變和5 種復合突變，占比由高到低以c.1388 G>A、c.1376 G>T、c.95 A>G、c.871 G>A 和c.392 G>T 這5 種突變為主，共占91.03%，未檢出c.383 T>C、c.592 C>T 兩種突變類型，突變類型和分布情況見表2。

3 討論

葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶（G6PD） 缺乏癥是最常見的一種遺傳性酶缺乏病，由位于X 染色上的G6PD 基因突變導致G6PD酶活性降低或缺乏，紅細胞不能抵抗氧化損傷而遭受破壞，從而引起溶血性貧血[8]。G6PD 基因定位于X 染色體長臂2 區8 帶（Xq28）[9]。男性攜帶者稱為半合子;女性兩條X 染色體都帶有致病基因時稱為純合子，僅一條X 染色體帶有致病基因時稱為雜合子。女性雜合子因酶的活性缺乏程度不同而臨床表現差異較大，女性純合子和男性半合子則表現為酶的活性顯著缺乏，臨床癥狀較重。

本研究采用的熒光PCR 溶解曲線法根據靶與探針雜交產物熔點的差異能夠一次性檢測12 種中國人群常見G6PD 基因突變類型，結果顯示茂名地區嬰幼兒的G6PD 基因突變類型以c.1388G>A、c.1376G>T 和c.95A>G 為主，占比分別為36.21%、30.90%、10.96%，這與國內報道的中國人群的主要突變類型是相符的，但所占比例存在一定差異;另外，檢出的其他突變類型也與其他地區存在差異性。這表明茂名地區G6PD 基因突變類型既具有中國人群普遍的特征，也具有本地區的特征性。

本研究326 例G6PD 缺乏癥患者中，有301 例樣本檢測出基因突變，包含10 種單一突變類型和5 種復合突變類型，在檢測范圍內未發現c.383T>C 和c.592C>T 兩種突變，這可能與檢測的標本量存在一定的關系。另外有25 例樣本未檢測到基因突變，一方面原因可能是部分篩查的樣本是由外院采集后送至本院檢測，標本運送時間長、保存不當或處理等因素均可能造成G6PD 酶活性降低;另一方面原因可能是G6PD酶活性受某些疾病或者藥物的影響而降低;最后也可能是存在試劑盒檢測范圍以外的基因突變類型，這有待后續通過其他檢測試劑盒或使用基因測序等方法進一步研究。因為受標本質量、疾病和藥物等因素影響，再加上部分女性雜合子G6PD 缺乏癥狀不明顯，所以臨床上單純依靠新生兒紙片法初篩和酶法檢測的結果來診斷G6PD 缺乏癥也還存在一定的缺陷。因此，進行G6PD 基因突變檢測還是很有必要的，能夠在基因層面為臨床提供更為準確的診斷依據。本研究采用的熒光PCR 溶解曲線法具有操作簡便、重復性好、準確度高、檢測覆蓋范圍廣等特點，該技術在本地區的應用，可為本地區進行大規模的G6PD 缺乏癥的分子流行病學調查提供技術保障。

綜上所述，本研究對茂名地區嬰幼兒G6PD 基因突變的類型進行分析，為本地區流行病學調查、臨床上診斷和預防G6PD 缺乏癥提供了有價值的參考依據。在嬰幼兒群體中應積極開展G6PD 缺乏癥的基因突變檢測，根據檢測結果指導臨床用藥和患兒家屬喂養，從而預防溶血性疾病的發生，有利于提高本地區的人口素質與健康。