東農冬麥1號TabZIP2基因的克隆及低溫和ABA作用下的表達調控

關 熒，劉 楠，蒼 晶，魏鐵鎖，吳晶晶，齊 越，郭富燁，李沅珊

(1.東北農業大學 生命科學學院，植物生理與分子生物學實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000；2.北京卓誠惠生生物科技股份有限公司，北京 100000)

小麥是我國主要的糧食作物，東農冬麥1號是首例能夠在黑龍江地區安全過冬的冬小麥品種，目前其體內很多相關抗寒基因已被研究。

轉錄因子(Transcription factor，TF)是已知響應各種環境和發育線索來調節基因表達的最重要的調節劑之一。人們對它們在減輕各種生物和非生物脅迫以及發育反應中的作用進行了深入研究。其中堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子代表最大和最多樣化的家族之一，并在真核生物中獨特存在。它參與真核生物的各種代謝途徑和應激反應。bZIP家族的明顯特征是存在一個基本的DNA結合結構域，該結構域也負責核定位，與參與二聚化的亮氨酸拉鏈結構域相鄰。

植物bZIP蛋白通過與帶有ACGT核心順式元件的DNA序列結合，例如ABRE、G-box(CACGTG)、C-box(GACGTC)、A-box(TACGTA)、AAGCT(T box)和GCN4基序即TGA(G/C)TCA，從而調節下游基因的表達，參與多種非生物脅迫[1-6]。 bZIP蛋白在激素反應、光信號傳導和光形態發生，種子發芽、成熟、花誘導和花發育中也發揮著重要作用[7-10]。bZIP轉錄因子在緩解各種生物和非生物脅迫以及發育反應方面的作用已經得到了很好的研究。如過表達TabZIP60的擬南芥植株對干旱、高鹽和低溫的抗性增強[11]；OsbZIP73與OsbZIP71相互作用并增強耐寒性[12]。在碳酸氫鹽堿性脅迫下，苜蓿中過表達GsbZIP67促進了植物的生長[13]。番茄的SlbZIP38在不同器官中有差異表達，并且在干旱、鹽脅迫和脫落酸(ABA)的作用下表達下調[14]。谷子SibZIP8轉錄因子在逆境脅迫中表達量顯著上調[15]。前期東北農業大學植物分子與生理實驗室研究過TabZIP1在冬小麥內抗寒性的研究，但是TabZIP2對強抗寒冬小麥抗寒性的影響則少有報道。

本研究首先對冬小麥中的TabZIP2基因進行克隆，然后運用生物信息學手段對其進行分析，并且通過qRT-PCR技術對冬小麥TabZIP2基因在寒脅迫下ABA調控的逆境響應進行相對表達量分析，可為深入探究TabZIP2調控冬小麥的抗寒機制奠定基礎，也可為揭示ABA調控信號的響應機制提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2017年9月在東北農業大學試驗田種植的強抗寒品種東農冬麥1號以及弱抗寒品種濟麥22，在三葉期噴施ABA，并于5，0，-10，-25 ℃(連續10 d最低溫度平均值)，分別取樣分蘗節和葉片，并放于-80 ℃的冰箱進行冷凍凍存[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 在提取冬小麥分蘗節和葉片的RNA時都是采用試劑盒進行提取。

1.2.2TabZIP的克隆 從東農冬麥1號中PCR擴增出TaZIP2的CDS序列(GenBank登錄號為KT224373.1)，PCR引物為Forward primer：5′-ATGGCATCGTCGCGGG-3′；Reverse primer：5′-CTACCATTCCATCGATTGGTC-3′。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 10 min；4 ℃ ∞。利用膠回收試劑盒(購自康為世紀)進行目的條帶回收，并將其連接到pClone007 Vector載體(購自擎科生物)。之后將其轉化到大腸桿菌感受態DH5，并且篩選陽性克隆送至哈爾濱擎科生物公司進行測序。

1.2.3 生物信息學的分析 在對蛋白基本理化性質進行生物信息學的分析時主要是使用PASy-ProtParamtool軟件進行[17]；通過使用SOPMA程序對蛋白質的二級結構進行預測；然后再使用ProtScale對蛋白質的疏水區和親水區進行在線程序預測；利用2.0版本的ClustalX和8.0版本的DNAMAN軟件對多序列比對進行分析[18]；搜索時利用NCBI中的BlastP、構建蛋白系統進化樹時使用MEGA 6.0軟件[19]；蛋白亞細胞定位的預測使用TargetP 1.1 Server，使用Ghlorop 1.1 Server對蛋白轉運肽進行預測。

1.2.4 表達模式分析 實時熒光定量PCR反應系統為Mx-3000p Real-Time PCR system。根據已得到的TabZIP2基因為模板設計引物。TabZIP2轉錄因子Forward primer：5′-AATGGTAGAAGTATCCGCAAGC-3′；Reverse primer：5′-GAACTAGAGTCCTTCCGCCTAA-3′。以TaActin(GenBank登錄號352987)基因為內參，Forward primer：5′-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3′；Reverse primer：5′-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3′。利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)對基因進行RT-qPCR，PCR反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，退火56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個循環；72 ℃ 1 min；4 ℃ ∞。利用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。每個基因的表達分析均進行3次生物學重復，最后的數據用SPSS進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 TabZIP2轉錄因子的克隆結果

分別以-10，-25 ℃的東農冬麥1號分蘗節的cDNA為模板，進行PCR擴增，并且進行瓊脂糖凝膠電泳，Marker為2 000 bp，電泳圖中2個處理各呈現出1條759 bp的特異性條帶(圖1)，在獲得目的基因之后對其進行膠回收，并使其連接到pClone007 Vector載體上，然后對形成的重組質粒進行大腸桿菌DH5α轉化并挑選單菌落，接著將單菌落放到LB液體培養基中進行培養，搖菌進行測序。利用DNAMAN軟件獲取序列并與已知序列比對，比對結果為2個序列基本一致，說明陽性重組體獲取成功。

M.DNA分子量標準DL2000；1.-10 ℃時TabZIP2的PCR產物；2.-25 ℃時TabZIP2的PCR產物。M.DNA Marker DL2000；1.PCR product of TabZIP2 at -10 ℃ ；2.PCR product of TabZIP2 at -25 ℃.

2.2 TabZIP轉錄因子的生物信息學分析

2.2.1 理化性質 利用PASy-ProtParamtool對TabZIP轉錄因子表達蛋白進行理化性質的預測，結果顯示：TabZIP2基因包含759 bp的完整開放閱讀框，其編碼的蛋白由252個氨基酸組成，分子式為C1118H1826N362O371S10，相對分子質量為26.595 6 ku，理論等電點(PI)為5.5，不穩定性系數(Instability index)為29.36(<40，蛋白穩定)，脂肪族系數(Aliphatic index)為61.43，由此可以得出TabZIP2為弱酸性穩定性蛋白質。

2.2.2 TabZIP2蛋白二級結構預測 利用SOPMA對TabZIP蛋白進行二級結構預測(圖2)，結果顯示TabZIP蛋白的α-螺旋(H)為130個，β-轉角(T)為6個，延伸片段(E)為14個，無規則卷曲(C)為102個；分別占總蛋白的51.59%，2.38%，5.56%，40.48%，其中α-螺旋(H)和無規則卷曲(C)占大部分。

圖2 TabZIP2蛋白二級結構的預測Fig.2 The second structure prediction of TabZIP2 protein

2.2.3 TabZIP2蛋白親水性和疏水性分析 在對TabZIP2蛋白親水性和疏水性進行分析時，需要使用ProtScale在線程序來進行預測和分析。一般情況下，TabZIP2蛋白親水性比較強時氨基酸的分值就會較低，TabZIP2蛋白疏水性比較強時氨基酸的分值就會較高。當多肽鏈達到218和219位時，氨基酸分值是最低的為-3.656，這時蛋白的親水性是最強的；當多肽鏈為103位時，氨基酸分值是最高的為1.533，這時蛋白的疏水性是最強的。由此可見，其疏水性氨基酸少于親水性氨基酸，因此，都是親水性蛋白質(圖3)。

圖3 TabZIP2蛋白的親水性/疏水性預測分析Fig.3 Predictive analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of TabZIP2 protein

2.2.4 TabZIP2蛋白的多序列比對結果 將TabZIP2與大麥(HordeumvulgareL.)、水稻(Oryzasativa)、黍(Panicumhallii)、高粱(Sorghumbicolor)的bZIP2蛋白開展多序列比對。其多序列比對結果表明，在TabZIP2蛋白中擁有一個堿性結構域和一個亮氨酸拉鏈區域，其堿性結構域是與DNA結合的，亮氨酸拉鏈區域具有二聚化作用(圖4)。

2.2.5 系統進化樹 用MEGA 6.0軟件對小麥與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻、黍、高粱、玉米(Zeamays)、華東葡萄(Vitispseudoreticulata)、海棗(Phoenixdactylifera)、刺苞菜薊(Cynaracardunculus)的bZIP堿基序列的系統發育進行分析。分析結果表明：二穗短柄草、水稻分為一組，TabZIP2的親緣關系與其較近；高粱、玉米和黍等單子葉植物為一組，即這些單子葉植物的bZIP聚類關系密切相關；華東葡萄、刺苞菜薊和海棗分為一組，TabZIP2的親緣關系與其較遠(圖5)。

藍色下劃線部分表示N端是完整的堿性結構域和C端是亮氨酸拉鏈結構域。The blue underlined part indicates that the N-terminus is a complete basic domain and the C-terminus is a leucine zipper domain.

圖5 9種植物的bZIP蛋白系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of bZIP proteins in 9 plants

2.2.6 TabZIP2蛋白亞細胞定位預測分析 在TargetP在線程序中輸入TabZIP2蛋白序列，然后應用在線程序對TabZIP2蛋白亞細胞定位進行預測分析，其中52.6%的TabZIP2蛋白定位在細胞核中、36.9%的TabZIP2蛋白定位在細胞膜中、5.3%的TabZIP2蛋白定位在細胞質中、9%的TabZIP2蛋白定位在其他部位，表明該蛋白亞細胞的定位是在細胞核中。使用Chlorop在線程序預測蛋白TabZIP2信號肽，結果為具有葉綠體轉運肽。

2.3 寒脅迫下東農冬麥1號與濟麥22號TabZIP2在不同組織中的表達分析

定量結果顯示(圖6)，東農冬麥1號分蘗節中TabZIP2的表達量在0 ℃時表達量降低，在-10 ℃時表達量上升并達到峰值，-25 ℃表達量又再次降低，但是高于5，0 ℃；與分蘗節相比，葉片中TabZIP2的表達量在0，-10 ℃時都顯著高于分蘗節，當溫度在-10 ℃時達到最高水平，可見與分蘗節相比，葉片要比其提前應答低溫脅迫。濟麥22分蘗節中TabZIP2的表達量先降低后恢復到5 ℃時的表達水平；葉片中TabZIP2表達量隨著溫度的降低呈先升高后降低趨勢，與東農冬麥1號相同的是，在0，-10 ℃時葉片中TabZIP2的表達量也都顯著高于分蘗節，并且同樣在-10 ℃表達量最高。從總體來看，0 ℃以后，東農冬麥1號分蘗節和葉片的TabZIP2表達量都較濟麥22的分蘗節和葉片表達量高。

不同小寫字母分別表示同一溫度下分蘗節與葉片差異在0.05水平上顯著。Different lower case letters indicate significant differences between the branching and the leaf at 0.05 at the same temperature.

2.4 ABA對不同溫度下東農冬麥1號分蘗節和葉片TabZIP2表達的影響

TabZIP2表達量在經過ABA處理后與對照組相比在分蘗節中表現為5 ℃下調、0 ℃上調，但差異不顯著(P>0.05)；-10 ℃上調表達，且差異顯著(P<0.05)。葉片中經ABA處理后TabZIP2表達量變化趨勢與分蘗節相似，但表達量變化倍數小于分蘗節(圖7)。

3 討論與結論

對于真核生物來講，轉錄調控無論在生物的生長發育中，還是在信號傳導上，又或是逆境的響應上都發揮了至關重要的作用。bZIP轉錄因子參與了植物的一系列發育過程和脅迫反應。前人研究表明，很多bZIP轉錄因子在從幼苗到植株的各種組織中都有表達。bZIPs的這種組織特異性表達證實了之前在小麥的研究中，如TabZIP1在冬小麥中隨著溫度的降低分蘗節中該基因的表達量大于葉片[20]；TaABP1受到ABA、高鹽、低溫和干旱的強烈誘導，其在莖和葉中的表達均強于小麥的根[21]。本試驗表明，TabZIP2在分蘗節和葉片中均有表達，且不同溫度下表達量存在差異?？傮w表現為在-10 ℃時TabZIP2在東農冬麥1號和濟麥22的分蘗節和葉片中表達量隨著溫度的降低逐漸升高；但-25 ℃時分蘗節的表達量高于葉片。可見，葉片要比分蘗節提前應答低溫。同時分蘗節和葉片都是在-10 ℃時TabZIP2的表達量處于峰值的狀態，而這一觀點與前期本實驗室驗證的冬小麥東農冬麥1號開啟抗寒機制的關鍵溫度點就是-10 ℃的結論相一致[22]。而0 ℃以后，東農冬麥1號分蘗節和葉片的TabZIP2表達量都較濟麥22的分蘗節和葉片表達量高。因此得出結論，TabZIP2的組織特異性表達在不同的小麥品種中表現出不同的表達譜，因此，初步判定TabZIP2的表達量變化情況能夠作為小麥抗寒性強弱的判斷指標。

不同小寫字母表示ABA處理與對照差異在0.05水平上顯著。Different lowercase letters indicate ABA treatment and CK at 0.05 level.

本研究對噴施外源ABA條件下東農冬麥1號分蘗節以及葉片的TabZIP2表達量與對照組進行了比較分析，揭示了它們在低溫脅迫條件下的差異表達。結果表明，寒脅迫下ABA處理能誘導TabZIP2基因的上調表達。這種反應可能是由于其啟動子區存在脫落酸反應元件。研究表明，一組重要的順式反應元件在其1 kb上游區域中被識別，主要包括脫落酸、生長素、乙烯和赤霉素的反應元件[23]。但在5，0 ℃時噴施ABA的分蘗節和葉片中TabZIP2的表達量沒有明顯變化，這可能是5，0 ℃時ABA處理過的東農冬麥1號幼苗中的TabZIP2還未對寒冷做出應答。0 ℃以下，隨著溫度的降低，寒脅迫和外源ABA共同作用，促進了TabZIP2上調表達。許多研究表明，脫落酸(ABA)參與調控植物的非生物脅迫。如小麥中TabZIP14-B在根、莖、葉和幼穗中表達，并通過外源ABA、鹽、低溫和聚乙二醇(PEG)脅迫處理上調[24]。AtbZIP1可以通過與ABRE元件結合調節植物對ABA處理的敏感性和下游ABA響應基因的表達，從而參與植物的ABA信號傳導通路[25]。

本研究首先克隆了東農冬麥1號中TabZIP2基因，之后以生物信息學手段為輔助，通過qRT-PCR技術對TabZIP2在寒脅迫下ABA調控的逆境響應進行分析，結果表明：東農冬麥1號分蘗節和葉片中的TabZIP2表達量高于濟麥22；ABA能夠正向調節TabZIP2的表達，初步判斷從而提高冬小麥的抗寒性。本研究初步探究了TabZIP2在東農冬麥1號抗寒方面發揮的功能，也為低溫下ABA信號調控機制提供了信息支持。