玉米大斑病菌StRTG2基因結構、原核表達及表達模式分析

李默曉，卞 哲，周啟慧，劉玉衛，鞏校東，谷守芹，韓建民

(河北農業大學 生命科學學院，河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001)

玉米大斑病是由病原真菌引起的玉米葉部病害，受病菌侵染后植株葉片先出現水漬狀斑點，之后沿葉脈向兩端擴展形成典型梭狀病斑，嚴重影響葉片光合作用[1-3]。其致病真菌為玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)，在高濕度及中等溫度條件下發生，感病品種嚴重感染時可致作物減產達50%以上，甚至絕收[4]。由于玉米大斑病菌變異頻繁，導致玉米大斑病的發病呈逐年上升的趨勢。因此，從分子水平上解析玉米大斑病菌生長發育及致病的分子機理已經成為該病害綜合防治的基礎研究之一。

前人研究表明，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)線粒體在細胞衰老過程中扮演重要角色，線粒體通過產生活性氧導致細胞衰老[5]。然而，線粒體在衰老過程中的作用遠不止于此，在衰老過程中積累的線粒體功能障礙引發逆行反應，這種細胞內信號通路可激活彌補這種功能障礙的基因[6]，而ScRtg2蛋白是線粒體逆行信號通路中的關鍵蛋白[7-8]。研究表明，酸脅迫通過Hog1激活觸發對乙酸誘導的調節細胞死亡的抗性，這需要酵母中的ScRtg2蛋白，且這個過程是獨立于依賴Rtg1/3的線粒體逆行信號通路的[9]。酵母中存在從線粒體到細胞核的通訊路徑，這個途徑需要2個酵母基因ScRTG1和ScRTG2[10-11]。迄今為止，關于玉米大斑病菌中RTG2同源基因功能的研究未見報道。

河北省植物生理及分子病理學重點實驗室前期研究發現，在玉米大斑病菌中存在3條MAPK(Mitogen activated protein kinase)通路[12]，其中HOG-MAPK途徑與調控植物病原真菌應對高滲脅迫相關，而StHOG1基因是該途徑的關鍵基因[13-14]。進一步的研究發現，該途徑關鍵基因StHOG1通過StRTG1/3間接調控轉錄因子StMSN2。本研究擬在玉米大斑病菌數據庫中搜索RTG2-like基因StRTG2的DNA基因組序列和cDNA序列，利用生物信息學分析其基因結構以及蛋白空間結構特征；構建該基因原核表達載體，在大腸桿菌BL21中進行StRTG2基因的原核表達；同時分析病菌5個重要發育時期(菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘)的RNA-Seq基因組數據庫，明確該基因的表達模式。該研究可為進一步分析StRTG2基因的功能以及其與StHOG1的互作關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

玉米大斑病菌野生型菌株01-23由河北省植物生理與分子病理學重點實驗室保存。高保真PCR Mix(諾維贊2×Rapid Taq Master Mix)、克隆載體pMD-19T、小型質粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit Ⅰ，OMEGA bio-tek)T4-DNA Ligase、限制性內切酶(QuickCutKPNⅠ，EcoR Ⅰ，TaKaRa)、大腸桿菌感受態(DH5α)、大腸桿菌感受態(BL21)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物科技公司；EasyPure Quick Gel Extraction Kit、A0120-便捷型植物RNA快速提取試劑盒購自天津華力科析科技有限公司；反轉錄試劑盒M5 Superpius qPCR RT with gDNA removor購自北京聚合美生物技術有限公司；Blue Plus V Protein Marker購自北京全式金生物技術有限公司；引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 玉米大斑病菌StRTG2的鑒定

利用酵母基因組數據庫SGD(https：//www.yeastgenome.org/)查找ScRtg2氨基酸序列；在玉米大斑病菌基因數據庫JGI(https：//mycocosm.jgi.doe.gov/)中進行BlastP，搜索其同源的氨基酸序列及其蛋白ID，在JGI中搜索蛋白ID獲得DNA及cDNA序列。根據其序列設計兩端引物(StRTG2-F：ATGGTTACGACAAACGAGTCACGACACC；StRGT2-R：TCACTCGGAGCCGTATGCCTCGCCATTCA)。分別以玉米大斑病菌01-23的全基因DNA以及cDNA為模板，利用高保真MIX進行PCR擴增，擴增體系為引物StRTG2-F、StRGT2-R各2 μL，2×Rapid Taq Master Mix 25 μL，cDNA/DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2min，共35個循環；72 ℃ 10 min，16 ℃保存。擴增結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，在照膠儀下進行比對觀察。

1.3 玉米大斑病菌StRTG2結構分析及系統發育分析

使用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)預測蛋白理化性質，利用Prab(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)預測蛋白的二級結構，利用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)預測蛋白的三級結構[15-16]。利用在線網站HMMER (https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)分析StRtg2的功能結構域。利用MEGA 7.0建立不同物種中的RTG2的系統進化樹[17]。

1.4 玉米大斑病菌不同發育時期材料的收集及RNA-Seq數據分析

選取玉米大斑病菌5個典型的發育時期(菌絲、分生孢子、芽管、附著胞、侵入釘)，分別采用如下方法收集材料。菌絲時期：選取在PDA上25 ℃黑暗培養7 d左右的野生型菌株，用去尖藍槍頭傾斜刮取菌絲體。分生孢子時期：選取PDA上25 ℃黑暗培養15 d左右的玉米大斑病菌，用棉簽刮去其氣生菌絲，將剩余基生菌絲繼續培養3 d，加入8 mL左右無菌水，小心晃動使ddH2O覆蓋整個皿面后，收集分生孢子懸浮液，12 000 r/min離心，獲得分生孢子。芽管、附著胞及侵入釘時期：在覆蓋有玻璃紙的水瓊脂培養基上加入分生孢子懸浮液后黑暗培養4 h后收集芽管，10 h后收集附著胞；16 h后收集侵入釘。以上試驗樣品需要設置3次重復。將以上材料送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行RNA-Seq分析。利用本實驗室獲得的玉米大斑病菌RNA-Seq數據庫，分析StRTG2在不同發育時期的表達模式。

1.5 玉米大斑病菌StRTG2在大腸桿菌BL21(DE3)中的原核表達

以玉米大斑病菌野生型01-23 cDNA序列為模板，設計引物進行PCR擴增(StRtg2-L：GGTACCATGGTTACGACAAACGAGTCACGACACCTGCA；StRtg2-R：GAATTCTCACTCGGAGCCGTATGCCTCGCCATTCACCGTCAC)，下劃線部分分別為限制性內切酶KPNⅠ和EcoRⅠ的內切酶識別部位。回收包含目的片段的瓊脂糖凝膠進行膠回收后，將回收產物連接至pMD19-T轉化入大腸桿菌感受態DH5α，利用氨芐抗性篩選后，挑取單克隆菌落進行菌液PCR，將條帶正確的菌液送至生工進行測序。用兩端限制性內切酶KPNⅠ和EcoRⅠ將測序正確的片段從pMD19-T酶切下來并用T4-連接酶連接至原核表達載體pET-30a上，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，利用卡那霉素抗性進行篩選。利用PCR驗證陽性菌落，將正確連接的質粒命名為pET30a-StRTG2，提取質粒對其進行酶切驗證。

將質粒pET30a-StRTG2轉化進入BL21感受態細胞中，加入LB培養基后37 ℃、220 r/min振蕩培養2～3 h，將菌液均勻涂布于LB固體培養基上(100 μg/mL的卡那霉素)，37 ℃過夜培養12 h，挑取陽性單克隆菌落，轉接于30 mL液體LB培養基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養12 h，作為種子液保存至4 ℃。取20 μL種子液于20 mL 2×YT培養基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養至波長在600 nm的吸光度值為0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mol/L，37 ℃繼續誘導培養6 h[18]。分別取1 mL誘導及未誘導的菌液于1.5 mL Ep管中，13 000 r/min離心10 min，保留沉淀。將沉淀用150 mL水重懸后吸取24 μL菌體于新Ep管，加入6 μL的5×上樣Buffer?；靹蚝髮悠贩兴?0 min，11 000 r/min離心10 min后，吸取上清，加入點樣孔內，利用SDS-PAGE膠進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 玉米大斑病菌StRTG2基因的克隆

在釀酒酵母基因組數據庫中搜索ScRtg2蛋白質序列，將其在玉米大斑病菌數據庫(JGI)中進行BlastP，得到了1個ScRtg2的同源序列，其蛋白ID號為33837；進一步分析發現該基因位于病菌基因正鏈scaffold_5的1 994 979-1 996 673位置，將該基因命名為StRTG2。 分別以玉米大斑病菌的DNA、cDNA為模板進行PCR擴增，得到了長度約為1 700 bp的擴增片段(圖1)，結果符合預期。將兩片段瓊脂糖凝膠進行回收，送至公司進行測序，發現其DNA、cDNA全長均為1 695 bp，不含有內含子。

M.DNA Marker (100～5 000 bp)；圖A中泳道1、2、3均為StRTG2基因以玉米大斑病菌野生型01-23的DNA為模板進行擴增的產物；圖B中泳道1、2、3均為StRTG2基因以玉米大斑病菌野生型01-23 cDNA序列為模板進行擴增的產物。

2.2 玉米大斑病菌StRtg2的理化性質、亞細胞定位及其高級結構分析

生物信息學分析表明，StRTG2基因所編碼的蛋白由564個氨基酸組成，其相對分子質量為62.069 44 ku，理論等電點值(pI)是6.96。在編碼的氨基酸中，丙氨酸(Ala)含量最高，所占比例是9.4%；其中帶負電的殘基數量為59，帶正電的殘基數量為58。結果還顯示，該蛋白不穩定系數(Ⅱ)為37.15，由此推測其為穩定蛋白。該蛋白親水系數為-0.205，說明該蛋白為親水性蛋白。跨膜結構域預測表明，該蛋白1-564位氨基酸均位于細胞膜外，屬于非跨膜蛋白。對其亞細胞定位預測，發現在27個最鄰近成員中，細胞質、細胞核、線粒體、過氧化物酶體中均有分布，根據結果分析得到，該蛋白分布于細胞質中的可能性比較大。

對StRtg2的二級結構進行預測，發現該蛋白的237個氨基酸構成α螺旋結構，占比為45.02%；81個氨基酸構成延伸鏈，占比為14.36%；246個氨基酸構成無規則卷曲，占比為43.62%。對其結構域分析，發現StRtg2蛋白中的25-342位氨基酸構成Ppx-Gppa結構域，358-368位氨基酸和489-500位氨基酸形成低復雜區域。對StRtg2的功能結構域分析，結果顯示，StRtg2具有典型的Ppx-Gppa保守結構域(即結構域)，該家族由外切磷酸酶(Ppx)的N末端以及EC：3.6.1.11和鳥苷五磷酸磷酸水解酶(GppA)EC：3.6.1.40組成(圖2)。

圖2 StRtg2功能結構域分析Fig.2 Functional domain analysis of StRtg2

對StRtg2的三級結構進行分析，得到StRtg2的三維空間模型，結果顯示，α螺旋與無規卷曲結構是三級結構中的主要組成部分，這與二級結構預測結果相符(圖3)。

圖3 StRtg2 三級結構預測Fig.3 Three dimensional structure prediction of StRtg2

2.3 玉米大斑病菌StRTG2基因進化關系分析

為進一步研究玉米大斑病菌與其他物種間的進化關系，對該基因蛋白序列進行BlastP，基于其他真菌物種中的氨基酸序列，利用MEGA 7.0鄰近法進行系統發育樹分析。分析結果表明，玉米大斑病菌與番茄匍柄霉菌(Stemphyliumlycopersici)的RTG2基因間的進化關系最近，其次是與釀酒酵母間的進化關系較近(圖4)。

圖4 RTG2系統進化分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of RTG2

2.4 玉米大斑病菌StRTG2在大腸桿菌BL21(DE3)中的原核表達

首先構建了StRTG2的原核表達載體，將目的基因連接終載后轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞，進行菌液PCR后，可以觀測到清晰的長度為1 600 bp左右的條帶，表明片段連接成功。將終載轉入BL21中，轉化后進行PCR檢測，也可觀察到1 600 bp左右的片段(圖5-A)，用限制性內切酶KPNⅠ/EcoRⅠ對載體進行酶切驗證。進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測到清晰的目的大小片段的條帶(圖5-B)，說明原核表達載體構建成功。

A.pET30A-StRTG2載體轉化至BL21菌液PCR驗證；B.終載pET30a-StRTG2，KPN Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切驗證圖。A. PCR diagram of pET30a-StRTG2 transferred into BL21；B. KPN Ⅰ/EcoR Ⅰ enzymatic verification of pET30A-StRTG2.

對誘導及未誘導菌液處理后進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，IPTG誘導的重組菌在70 ku左右的位置出現條帶(圖6)，而生物信息學預測StRtg2蛋白約62 ku左右。說明StRTG2原核表達成功。

圖6 StRTG2基因的原核表達Fig.6 Prokaryotic expression of StRTG2

2.5 玉米大斑病菌StRTG2不同發育時期的表達模式分析

基因表達模式的分析可對基因功能研究起重要作用，為進一步探索StRTG2的功能，利用RNA-Seq數據分析了該基因在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘時期5個典型的發育時期的表達模式。結果發現，StRTG2在上述5個時期均有不同水平的表達。與菌絲時期相比，分生孢子、芽管、附著胞、侵入釘時期表達量分別為菌絲時期的1.02，0.51，1.05，0.73倍，結果說明，StRTG2在附著胞時期表達量最高，在芽管時期最低(圖7)，即該基因在玉米大斑病菌5個典型的發育階段雖有差異，但均有表達。說明StRTG2基因參與病菌生長發育的調控過程。

圖7 StRTG2在不同發育時期的表達模式分析Fig.7 Expression patterns analysis of StRTG2 in different developmental stages

3 討論與結論

已有研究表明，ScRTG2基因參與酵母的線粒體逆行信號通路并且該基因表達水平影響細胞壽命[19]；在煙曲霉相關研究中表明，給分生孢子提供含有營養的培養條件后，RTG2同源基因表達受抑制，表明該基因可能在調控病菌分生孢子休眠狀態過程發揮作用[20]；本研究首次擴增玉米大斑病菌中StRTG2基因并對StRtg2蛋白進行保守結構域及系統進化分析，結果表明，StRtg2蛋白與釀酒酵母ScRtg2蛋白親緣關系較近，也含有保守的Ppx-Gppa結構域，推測該基因所編碼的蛋白在玉米大斑病菌中也可能具有磷酸水解酶活性。

另有文獻表明，酵母在抵抗由乙酸誘導的調節性細胞死亡的過程中RTG2與HOG1間可能有直接調控作用[8]，本實驗室前期研究結果顯示，StHOG1對StRTG3具有調控作用，而RTG復合體又是線粒體逆行信號通路中的關鍵調控因子。因此，可以推測HOG通路間可能與RTG線粒體逆行信號通路間存在交叉調控[21]。

本研究利用生物信息學技術對StRtg2蛋白進行了結構分析及系統進化分析，誘導表達了StRtg2蛋白，但StRTG2的基因功能及其與HOG-MAPK途徑間交叉調控的機制還有待研究。因此，在后續的研究中，應利用基因沉默及過表達技術進一步探究StHOG1基因與StRTG2基因間調控關系，并在蛋白水平驗證兩者是否互作。明確StRTG2的基因功能及其對病菌致病性的影響，為制備殺真菌藥物制劑制備提供理論基礎。

本研究通過擴增StRTG2基因序列，發現其全長為1 695 bp，不含有內含子；構建StRTG2的原核表達載體并誘導表達，顯示其蛋白大小約70 ku；該基因編碼的蛋白為穩定蛋白，含有保守的Ppx-Gppa結構域，定位于細胞質中的可能性較大；該基因在玉米大斑病菌附著胞時期表達水平最高，芽管時期最低，表明該基因可能對病菌附著胞發育過程具有一定調控作用。