肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1對喉癌細胞系Hep-2細胞生物學行為的影響

王輝，李章富，溫行，劉劍利，李福才

（中國醫(yī)科大學生命科學學院醫(yī)學遺傳學教研室，沈陽 110122）

喉癌是一種主要起源于喉黏膜上皮組織的惡性腫瘤。近年來研究［1］顯示喉癌的5年存活率未見提高，且診斷缺乏分子水平臨床特征。因此，闡明影響喉癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制至關(guān)重要。肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1（peptidylprolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1）能特異地識別和結(jié)合蛋白質(zhì)磷酸化絲/蘇-脯氨酸基序，催化磷酸化絲/蘇-脯氨酸肽鍵發(fā)生順反異構(gòu)［2］。研究［3］顯示，人類多種癌癥中Pin1 蛋白高表達，進而上調(diào)癌蛋白表達，擾亂細胞周期進程。Pin1通過磷酸化依賴的泛素通路，催化它的底物結(jié)構(gòu)發(fā)生順反異構(gòu)，從而避免癌蛋白降解［4］。除了穩(wěn)定和激活癌蛋白之外，Pin1 可以使大量腫瘤抑制因子和生長抑制因子失活。研究［5］顯示乳腺癌組織中Pin1過表達與中心體擴增有關(guān)。在基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞中，Pin1過表達可促進中心體擴增，但Pin1調(diào)節(jié)中心體擴增的分子機制尚不清楚。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB）異常激活在人類許多癌癥中均有發(fā)現(xiàn)［6］。肝癌細胞中Pin1通過介導(dǎo)NF-κB活化而促進腫瘤的發(fā)生［7］。NF-κB是可誘導(dǎo)的二聚體核轉(zhuǎn)錄因子，p50/p65異源二聚體為NF-κB家族的主要形式。前期研究［8］發(fā)現(xiàn)NF-κB可以特異性地結(jié)合細胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）啟動子區(qū)，增強 CDK2表達，并調(diào)節(jié)中心體擴增。本研究探討Pin1對喉癌細胞系Hep-2細胞中心體擴增以及生物學行為的影響，旨在為闡明喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人喉癌細胞系Hep-2細胞購自中國科學院上海生命科學研究所。Pin1的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及陰性對照由廣州銳博公司合成。其他材料包括RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibeo公司），四季青胎牛血清（浙江天杭公司），細胞周期檢測試劑盒（中國 KeyGEN BionTECH公司），Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit 1（美國BD公司），Cell Counting Kit-8（中國 Dojindo公司），RNAiso Plus、SYBR Premix Ex TapⅡ、Primescript RT reagent kit（perfect real time）（日本TaKaRa公司），來源于鼠GTU-88雜交瘤抗γ微管蛋白單克隆抗體、NF-κB/p65抗體（美國Sigma公司），Pin1抗 體、CDK2抗 體、β-actin抗 體（美 國Proteintech公司），山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Alexa Flour-488標記抗小鼠IgG二抗（美國 Invitogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人喉癌細胞系Hep-2細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素 ），置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 Pin1的siRNA構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及分組：Pin1的siRNA，靶序列5’-CATTTGAAGACGCCTCGTT-3’；正義鏈5’-CAUUUGAAGACGCCUCGUUdTdT-3’；反義鏈3’-dTdTGUAAACUUCUGCGGAGCAA-5’。細胞接種于6孔板中，在含10%小牛血清培養(yǎng)基中生長至60%～80%融合。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照脂質(zhì)體說明書操作。Pin1過表達分為3組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組（NC組）、轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-Pin1組（Pin1組）、轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-Pin1后加NF-κB/p65抑制劑（BAY11-7082）組（Pin1+7082組）。Pin1干擾分為3組：轉(zhuǎn)染陰性對照組（NC組）、轉(zhuǎn)染siRNA組（Si-Pin1組）、轉(zhuǎn)染siRNA后加NF-κB/p65激活劑（IL-1β）組（Si-Pin1+IL-1β組）。

1.2.3 免疫熒光檢測：各組細胞爬片，-20 ℃預(yù)冷甲醛溶液中固定20 min，預(yù)冷丙酮溶液-20 ℃再固定6 min，1%牛血清白蛋白（BSA）封閉0.5 h，分別加入1 ∶50稀釋的γ-Tubulin抗 體、p65抗 體（1 ∶100），4 ℃濕盒孵育過夜，漂洗后加入Alexa Flour-488標記抗小鼠IgG二抗，37 ℃濕盒孵育0.5 h，結(jié)束后DAPI復(fù)染，10 min后熒光顯微鏡下觀察細胞2極至多極中心體分裂情況、每組計數(shù)4張載玻片，中心體異常=2極以上分裂細胞數(shù)/總分裂細胞數(shù)×100%。

1.2.4 CCK-8檢測各組細胞增殖情況：常規(guī)細胞鋪板并轉(zhuǎn)染后，分別將各組細胞重懸，2×103/孔加入細胞懸液鋪96孔板。每組5個復(fù)孔，每孔加入完全培養(yǎng)基補齊體積至100 μL，37 ℃孵育培養(yǎng)，每12 h測定1次，測試前每孔加入10 μL CCK-8試劑，混勻，37 ℃孵育2 h。酶標儀于450 nm處測定吸光度值（optical delnsity，OD）。

1.2.5 細胞凋亡檢測：常規(guī)細胞鋪板并轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，利用Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit試劑盒檢測細胞凋亡情況，每個樣品抽取1×105個細胞進行流式細胞儀檢測。

1.2.6 細胞周期測定：胰酶消化細胞后離心，用含有PBS溶液（300 μL）重懸細胞，加入700 μL無水乙醇固定過夜，第2天離心并用PBS溶液清洗2遍，溴化丙啶染色后流式細胞儀檢測。

1.2.7 Transwell檢測：各組細胞利用無抗生素、無血清培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于Transwell小室上室，5×104/孔，每組3個復(fù)孔。下室加入含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（600 μL）。培養(yǎng)24 h后將上室底部濾膜用4%甲醛固定30 min，蘇木素染色40 s，伊紅染色3 min。PBS洗滌風干后顯微鏡下拍照計數(shù)。

1.2.8 劃痕實驗：藥物處理前用 200 μL移液管頭在細胞板的中央做一劃痕，立即在顯微鏡下觀察并拍照記錄，設(shè)定為 0 h；藥物處理24 h 再次在顯微鏡下觀察并拍照記錄，設(shè)定為 24 h，劃痕的寬度分別為A0和A24，遷移距離=A24-A0。

1.2.9 克隆形成實驗檢測腫瘤細胞集落形成能力：常規(guī)細胞鋪板并轉(zhuǎn)染后，分別將各組細胞重懸，將細胞濃度調(diào)整至3×104/mL后，移取100 μL至6孔板內(nèi)，加2 mL新鮮完全培養(yǎng)基搖勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞團個數(shù)達到50個左右，固定并以蘇木素染色。

1.2.10 實時PCR檢測細胞中Pin1及CDK2mRNA表達：收獲培養(yǎng)的細胞，提取細胞總RNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增PIN1、CDK2基因，同時以GAPDH基因作為內(nèi)參照。引物序列為：GAPDH，上游，5’-TG CACCACCAACTGCTTAG-3’，下 游，5’-GACGAGGGAT GATGTTC-3’；Pin1，上 游，5’-ATGGCGGACGAGGAG A-3’，下游，5’-TGGCTGGCGTTAGTGAT-3’；CDK2，上游，5’-GTGGGCCCGGCAAGATTTTAG-3’，下游，5’-G CCGAAATCCGCTTGTTAGGG-3’。采用2-ΔΔCt表示實驗組目的基因相對于對照組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異。

1.2.11 Western blotting 檢測：總蛋白采用RIPA 裂解液充分裂解細胞、提取蛋白。核蛋白按照Scientific Pierce NE-PER試劑盒說明書抽提核蛋白、胞質(zhì)蛋白，均置于100 ℃變性 5 min。配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，待變性結(jié)束將樣本加入點樣孔中進行垂直電泳（80 V 20 min，120 V 80 min）和電轉(zhuǎn)膜（350 mA 45 min）。轉(zhuǎn)膜完成后取出硝酸纖維素膜并用5%脫脂牛奶封閉過夜（4 ℃），第2天取出膜TBST溶液洗滌3 次，分別孵育Pin1、actin、CDK2、p65一抗，過夜后取出膜TBST 溶液洗滌3次，然后用辣根過氧化物酶標記的第二抗體37 ℃孵育，2 h 后再次TBST 溶液洗滌3次。顯影后計算蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值作為蛋白含量，對照組蛋白含量作為1。

1.3 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Pin1經(jīng)NF-κB/p65通路對細胞中心體異常擴增的影響

在Hep-2細胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pin1和siRNA來改變Pin1表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pin1 能夠使Pin1表達顯著提高（圖1A），而轉(zhuǎn)染siRNA能夠有效降低Pin1表達（圖1B）。免疫熒光實驗結(jié)果顯示，中心體在Hep-2細胞中出現(xiàn)異常擴增（圖1C）。Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組Hep-2細胞中心體異常擴增的細胞數(shù)目比例增加（P＜ 0.05），而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（圖1D）。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組中心體異常擴增的細胞比例顯著降低（P＜ 0.05），IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)（圖1E）。提示Pin1能夠通過NF-κB通路上調(diào)中心體異常擴增。

圖1 Pin1經(jīng)NF-κB/p65通路對細胞中心體異常擴增的影響Fig.1 Effect of Pin1 on abnormal centrosome amplification via NF-κB/p65 pathway

2.2 Pin1經(jīng)NF-κB/p65對細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗檢測細胞增殖能力結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組細胞增殖能力無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05）；而BAY11-7082能夠抑制細胞增殖能力（圖2A）。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組細胞增殖能力顯著減弱（P＜ 0.05），IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)（圖2B）。

Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組克隆形成數(shù)目顯著增加，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（均P＜ 0.05，圖2C）。Hep-2細胞Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組克隆形成數(shù)目顯著減少，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（均P＜ 0.05，圖2D）。表明Pin1可通過NF-κB通路促進Hep-2細胞克隆形成。

圖2 Pin1經(jīng)NF-κB/p65通路對細胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of Pin1 on cell proliferation capacity via NF-κB/p65 pathway

2.3 Pin1對細胞周期和凋亡的影響

流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組G1期細胞減少，S期細胞增加，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的調(diào)節(jié)作用（均P＜ 0.05，圖3A）。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組G1期細胞增加，S期細胞減少，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（均P＜ 0.05，圖3B）。提示Pin1能夠通過NF-κB通路促進G1/S期的轉(zhuǎn)化，而加入NF-κB/p65抑制可以消減G1/S期的轉(zhuǎn)化作用，Pin1通過NF-κB通路對細胞周期產(chǎn)生影響。

流式細胞儀檢測Hep-2細胞凋亡結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組細胞凋亡無明顯差異，而BAY11-7082使細胞凋亡增加（圖3C）。Hep-2細胞Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組細胞凋亡增加，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（圖3D）。說明Pin1通過NF-κB/p65 對細胞凋亡發(fā)揮作用。

圖3 Pin1對細胞凋亡和周期的影響Fig.3 Effect of Pin1 on cell cycle and apoptosis

2.4 Pin1對細胞遷移的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組穿過膜細胞數(shù)顯著增加，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（均P＜ 0.01，圖4A）。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組穿過膜細胞數(shù)減少，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（均P＜ 0.01，圖4B）。

劃痕實驗結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組細胞遷移距離顯著增加，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（均P＜ 0.01，圖4C）。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組遷移距離顯著減少，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（均P＜ 0.01，圖4D）。說明Pin1可通過NF-κB通路促進Hep-2細胞遷移。

圖4 Pin1對細胞遷移的影響Fig.4 Effect of Pin1 on cell migration

2.5 Pin1對NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組核中NF-κB/p65蛋白表達增加，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（圖5A）；Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組核中NFκB/p65蛋白表達減少；IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（圖5B）。

Western blotting檢測結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組NF-κB/p65核內(nèi)蛋白顯著增多，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（均P＜ 0.05）；而Pin1組、NC組及Pin1+7082組的細胞質(zhì)中NF-κB/p65蛋白表達比較無統(tǒng)計學差異（均P＞ 0.05），見圖5C。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組NF-κB/p65核內(nèi)蛋白減少，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（均P＜ 0.05，圖5D）。說明Pin1能夠促進NF-κB/p65入核。

圖5 Pin1對NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位的影響Fig.5 Effect of Pin1 on nuclear translocation of NF-κB/p65

2.6 Pin1對CDK2表達的影響

實時PCR檢測結(jié)果顯示，Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1組CDK2表達上調(diào)，而BAY11-7082能夠抑制Pin1過表達的上調(diào)作用（均P＜ 0.05，圖6A）。Pin1干擾中與NC組比較，Si-Pin1組CDK2表達下調(diào)，IL-1β能夠逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)（均P＜ 0.01，圖6B）。Western blotting蛋白檢測結(jié)果與實時PCR檢測結(jié)果一致，見圖6C、6D。提示Pin1促進NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位，上調(diào)CDK2的表達，可能通過NF-κB通路對CDK2表達產(chǎn)生影響。

圖6 Pin1經(jīng)NF-κB/p65通路對CDK2表達的影響Fig.6 Effect of Pin1 on CDK2 protein expression via NF-κB/p65 pathway

3 討論

研究［9-10］表明，中心體功能障礙可能導(dǎo)致癌癥，有些癌癥是源于中心體功能障礙引起的染色體異常。中心粒分裂出現(xiàn)在G1期晚期，復(fù)制始于S期早期，隨著中心體在G2期分裂，中心體復(fù)制完成，中心體分離延遲和加速都增加了中期紡錘體幾何缺陷和有絲分裂錯誤。在Cyclin B2過表達細胞中，中心體分離加速能導(dǎo)致中期異常紡錘體定位，形成雙極牽引動粒和染色體滯后，而在Cyclin B2過表達大鼠中G2期加速中心體分離是促進腫瘤的關(guān)鍵因素。

Pin1和NF-κB都參與細胞周期的調(diào)控，二者可能與中心體異常擴增相關(guān)。前期實驗［11］發(fā)現(xiàn)在喉癌細胞系Hep-2細胞中過表達Pin1加劇了中心體異常擴增，本研究結(jié)果表明Pin1可以通過NF-κB/p65通路作用于Hep-2細胞而影響其生物學行為。NF-κB能夠被多種基因磷酸化，從而調(diào)節(jié)NF-κB通路的活性［12］。NF-κB p65/p50二聚體和IκBα關(guān)聯(lián)，在調(diào)控p65核轉(zhuǎn)位以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［13］。Pin1特異性結(jié)合p65的pThr254-Pro序列并且抑制了p65和IκBα的結(jié)合，導(dǎo)致p65在細胞核積累以及p65蛋白穩(wěn)定增加［14］。此外，Pin1可以和Tax結(jié)合，調(diào)節(jié)Tax介導(dǎo)的NF-κB激活［15］。本研究證實了Pin1在Hep-2細胞中可以促進NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位，與以往研究結(jié)果一致。另一方面，NF-κB受反饋抑制機制調(diào)控，通過NF-κB激活補充稀少的IκB蛋白。IκB可直接作用于NF-κB，新合成IκB（特別是IκBa）進入細胞核結(jié)合到NF-κB二聚體上，并且將NF-κB運回細胞質(zhì)中失活［16］。本研究結(jié)果顯示在Hep-2細胞Pin1過表達中與NC組比較，Pin1過表達后細胞增殖及凋亡都無明顯變化，可能是Pin1過表達使得NF-κB激活，隨后通過上述的IκB反饋機制抑制了NF-κB的活性。然而具體的調(diào)控機制有待進一步研究。

研究［17-19］顯示NF-κB信號傳導(dǎo)通路通過CDK2來調(diào)控細胞周期。而且CDK2在細胞分化和有絲分裂中起促進作用。CDK2活性增強可促進細胞分裂、增殖和分化。Cyclin E/CDK2是促進G1/S進程的關(guān)鍵激酶復(fù)合物。CDK2表達正常時，Cyclin E/CDK2復(fù)合物表達水平保持不變并調(diào)控細胞周期進程正常進行，但CDK2表達異常時可影響多種細胞生物學行為，包括干擾細胞周期進程、促進細胞增殖和分化等，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［20-23］。本研究結(jié)果顯示Pin1過表達刺激細胞CDK2表達上調(diào)，而NF-κB/p65抑制劑可消除此上調(diào)作用。

綜上所述，在Hep-2細胞中，Pin1促進NF-κB/p65核轉(zhuǎn)位，上調(diào)CDK2的表達。Pin1可能是通過NF-κB通路調(diào)節(jié)CDK2表達，從而影響腫瘤細胞的中心體異常擴增、克隆形成、細胞遷移、細胞增殖等生物學行為。本研究為揭示喉癌的發(fā)生發(fā)展機制提供了理論基礎(chǔ)。