耐力運動對人外周血微RNA表達譜的影響

孫庭漢，劉美，孫曉

（中國醫科大學 1.體育部；2.藥學院離子通道藥理研究室，沈陽 110122）

科學適宜的耐力運動對慢阻肺、糖尿病等具有較好的保健和治療效果［1-2］。對骨骼肌全基因組表達分析后發現，運動能夠顯著上調三羧酸循環相關的基因表達，說明運動能夠調控能量代謝［3］。運動對身心健康的積極影響已被廣泛研究。目前關于遺傳信息與體育活動相關性以及運動影響體內分子過程的研究仍然有限。

微RNA（microRNA，miRNA）是一類普遍存在于動植物體內的非編碼小分子RNA，miRNA在基因轉錄后調控中發揮核心作用，可通過調節靶基因的表達發揮多種生物學功能［4］。機體內的miRNA在運動誘導的肌肉結構重塑、能量代謝和免疫調節等作用中起關鍵作用［5-6］。不同訓練模式可能導致體內循環miRNA發生改變，由于miRNA在血漿或血清中的穩定性，循環miRNA可以作為一種潛在的生物標志物。

本研究通過生物信息學方法分析經8周耐力運動前后健康受試者外周血中miRNA的表達譜變化，預測差異表達miRNA作用的靶基因及可能的靶向信號通路，為后續的機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 芯片數據來源

本研究從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）公 共基因芯片數據平臺（gene expression omnibus，GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載基因芯片數據集GSE133910，該研究共納入23例健康且未經鍛煉的受試者，其中男13例，女10例，平均年齡（47.9±8.3）歲（范圍為30～63歲），體質量為（82.0±13.1）kg，身高為（173.9±7.0）cm。未經鍛煉的納入標準為：既往無競技耐力訓練，入組前1年每周運動時間＜1 h，男性最大攝氧量（maximal oxygen consumption，VO2max）＜ 45 mL/（min·kg），女 性VO2max ＜40 mL/（min·kg）。受試者經8周的耐力運動，每周進行4次45 min運動訓練，可以選擇持續步行或慢跑，通過心率監測方式保證整個運動過程中，心率儲備（heart rate reserve，HRR）強度保持在70%以上。然后對受試者外周血中的miRNA表達譜進行分析，對照耐力運動前后外周血中miRNA水平的變化。PAXGene Blood miRNA試劑盒（德國Qiagen公司）分離出包括小RNA在內的總RNA。通過采集全血，應用PAXGene全血miRNA分離試劑盒（德國凱杰公司）分離出包括小RNA在內的總RNA。檢測的基因芯片平臺為GPL25134 Agilent-070156 Human_miRNA_V21.0_Microarray 046064（miRNA ID version），芯片共檢測了2 549個miRNA。

1.2 差異表達miRNA篩選

用R語言軟件讀取下載矩陣文件，使用limma包對耐力運動后和運動前受試者的外周血miRNA表達譜進行分析，得到差異表達miRNA。篩選標準為log2基因表達差異倍數（fold change，FC）絕對值≥1，由于miRNA和靶基因的關系為一對多，為了降低出現假陽性結果的概率，在miRNA靶基因篩選時，以P＜ 0.01作為統計學差異表達的判定標準。利用R語言ggplot2包繪制耐力運動前后外周血差異表達miRNA的火山圖。

1.3 差異miRNA靶基因篩選

miRNA在體內主要結合在靶基因的3’UTR，下調靶基因的表達。miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）是用于預測miRNA靶基因的開源在線分析工具［10］。首先應用miRWalk中的外聯數據庫miRDB對耐力運動前后差異表達的miRNA進行靶基因預測，設定閾值為0.9，獲得靶基因數據集A；再利用DIANA tools中的MicroT-CDS數據庫（http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/）對差異表達的miRNA進行靶基因預測［11］，獲得靶基因數據集B。然后，不同數據獲得的差異表達miRNA靶基因取交集作為差異miRNA的靶基因。利用Cytoscape軟件對篩選的差異表達miRNA和靶基因進行網絡分析。

1.4 差異miRNA靶基因的GO和KEGG分析

本研究通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數據庫［12］在線分析提供所需的基因本體論（gene ontology，GO）生物功能富集數據，GO按照生物途徑（biological process，BP）、細胞定位（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）對基因進行注釋和分類。除此之外，進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析［13］，從而發現差異miRNA可能參與的生物學通路。采用EASE Score或Fisher Exact統計方法，GO和KEGG各項篩選條件為P＜ 0.05。應用R語言ggplot2包根據分析結果繪制氣泡圖。

1.5 蛋白間相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建和關鍵基因篩選

STRING（https：//string-db.org/）網站是用于評估PPI的在線分析工具［14］。將本研究篩選出的所有差異表達miRNA靶基因導入STRING（版本11.0）分析工具，探討它們之間可能的相互作用關系。設置篩選條件為互作最大值=0，最小互作得分≥ 0.40。通過STRING得到PPI網絡后，把STRING的計算結果導入Cytoscape（版本3.7.2）［15］，應用Cytoscape插件cyto-Hubba依據Closeness值大小，篩選出PPI網絡中處于關鍵位置的前10個基因進行分析。

2 結果

2.1 耐力運動前后外周血中差異miRNA的篩選

本研究選用基因表達芯片GSE133910，經統計分析，健康受試者經8周耐力運動后，外周血中共篩選出8個差異表達的miRNA，其中2個miRNA表達上調，6個miRNA表達下調（FC≥ 2，P＜ 0.01），其中hsamiR-8052、hsa-miR-6889-5p和hsa-miR-4457變化最為明顯，見表1。利用火山圖分析和觀察FC值2倍以上變化的miRNA分布及統計學差異，其中標注為灰色的是FC值2倍以下或者P＞ 0.05的基因，表達下調的基因標注為藍色，表達上調的基因標注為紅色，見圖1。

表1 耐力運動后外周血差異表達的miRNA分析Tab.1 Analysis of miRNA differentially expressed in peripheral blood after endurance exercise

圖1 8周耐力運動后血中miRNA表達變化火山圖Fig.1 Volcano plot profiling miRNA differential expression in human peripheral blood between trained and untrained groups

2.2 差異miRNA靶基因的篩選

分別通過miRWalk及microT-CDS數據庫篩選出差異表達miRNA靶基因進行分析（圖2），由miRWalk數據庫篩選出靶基因1 424個，由microT-CDS數據庫篩選出靶基因1 030個。利用R語言的VennDiagram包對2組數據進行韋恩圖分析，可見2個數據庫共同預測的靶基因個數為251個。韋恩圖結果顯示（圖2），可差異miRNA有較多共同的靶基因。將miRNA及其調控的靶基因，通過Cytoscape軟件進行可視化，見圖3。

圖2 miRWalk和microT-CDS數據庫預測miRNA靶基因的韋恩圖Fig.2 Venn diagram demonstrating the overlap between target genes of differentially expressed miRNA predicted with the miRWalk and microT-CDS databases

圖3 差異miRNA靶基因及通路互作圖Fig.3 Visualization of interactions between differentially expressed miRNAs and their corresponding target genes

2.3 差異miRNA靶基因GO和KEGG富集分析

采用DAVID數據庫對預測的差異表達miRNA靶基因進行GO和KEGG信號通路富集分析，見圖4。GO富集分析發現，差異表達miRNA靶基因主要參與離子通道結合、突觸后致密蛋白結構域結合、mRNA結合等分子功能；BP主要涉及外在凋亡通路、GTP酶激活、同種細胞黏附、抑制RNA聚合酶Ⅱ啟動子等；CC在質膜、核膜等部位。KEGG通路分析結果顯示，miRNA靶基因主要與多個腫瘤信號通路、谷氨酸能突觸、Wnt信號通路、甘油磷脂代謝通路等有關。

圖4 差異表達miRNA靶基因GO和KEGG通路富集分析Fig.4 GO and KEGG pathway enrichment analysis of differential miRNA target genes

2.4 差異表達miRNA靶基因PPI網絡分析

將251個差異表達miRNA靶基因導入STRING進行分析后得到PPI網絡，該網絡由251個節點蛋白和285條相互作用關系構成（PPI enrichmentP=1.29×10-4）。將STRING分析結果導入Cytoscape，利用插件cytoHubba對候選miRNA靶基因的closeness篩選出的前十個關鍵基因分別為PRKACA、SMURF1、RHOA、GNAO1、CBL、UBE2D2、GSK3B、GNAQ、BCL2L1和RRAS2（圖5），關鍵基因用黃色、橙色、紅色標注，顏色越深表明該基因在網絡中的作用越為重要。篩選出的關鍵基因主要分布在能量代謝平衡、細胞增殖等通路。

圖5 CytoHubba插件篩選出PPI網絡中處于關鍵位置的基因Fig.5 The top 10 hub genes in the PPI network selected by cytoHubba

3 討論

miRNA是機體內廣泛分布的一類小RNA，主要通過誘導mRNA的降解或干擾蛋白質的翻譯過程，發揮轉錄后調控作用。耐力運動能夠通過調控相關miRNA的表達，有效提高機體肌肉的強度，增強心血管功能，同時對改善呼吸、血液、能量代謝等功能具有積極影響［7］。

在本研究中，通過對經8周耐力運動后的健康受試者外周血miRNA水平進行檢測，共發現8個miRNA（FC≥2，P＜ 0.01），分別是miR-8052、miR-6835-5p、miR-6881-5p、miR-6889-5p、miR-6766-5p、miR-4278、miR-4457和miR-1297。其中，研究［8］發現miR-6835的表達與血管內皮的炎癥和脂滴形成有關，脂聯素受體1（adiponectin receptor 1，AdipoR1）被證明是miR-6835-5p的直接靶基因，而miR-6835-5p通過抑制AdipoR1的表達可刺激胰島素的分泌，對于2型糖尿病可能是一種有效的治療方法［9］。在耐力運動后，健康受試者外周血的miR-6835-5p的表達顯著升高，從而抑制AdipoR1的表達，從而影響糖類和脂肪的代謝過程，進而影響機體的能量代謝［10］。研究［11-12］發現miR-6881的表達與人脂肪干細胞的成骨分化有關，血清miR-1297可作為蛛網膜下腔出血及多種腫瘤的生物標志物，并可能影響腫瘤的發生發展。

通過數據庫對差異表達的miRNA靶基因進行預測，結果顯示共有251個靶基因可能受到差異miRNA的靶向作用。本研究富集的KEGG信號通路及通路中富集的基因為后續運動對腫瘤作用機制的研究提供一定的參考。KEGG通路還涉及細胞增殖、能量代謝（GTP酶激活通路）和脂質代謝通路等。1項對健康老年人肌肉的全基因組分析研究［13］發現，經耐力運動后與能量代謝、物質代謝、肌肉質量、肌肉收縮、肌肉成分信息轉導和亞鐵血紅素的生物合成等相關基因表達改變。

此外，本研究經cytoHubba篩選出的關鍵基因中PRKACA（cAMP依賴性蛋白激酶A催化亞基α）能夠調節多種蛋白的翻譯表達，包括離子通道蛋白、轉錄激活蛋白和糖原代謝調節酶的表達［14］。SMURF1與多種重要的生物學途徑相關，包括骨生成途徑、非經典的Wnt途徑和促分裂原活化的蛋白激酶途徑等，并且研究［15］發現SMURF1在骨骼形成和腫瘤細胞侵襲方面與年齡和生理狀態有關。GSK3B除能夠調控糖原合成酶的活性外，還能作用于眾多信號蛋白、結構蛋白和轉錄因子［16］。通過本研究結果及查閱相關文獻結合既往研究，猜測耐力運動可能通過miR-6835-5p/PRKACA通路調控機體的能量代謝平衡，通過miR-6766-5p/SMURF1通路促進骨骼生長，或通過miR-6881-5p/GSK3B通路調控糖代謝等。本課題由于未進行相應的驗證，具有一定的局限性，后續將開展進一步的機制研究。

綜上，本研究發現耐力運動顯著影響外周血miRNA的表達水平，差異表達的miRNA可能通過腫瘤、能量代謝、糖代謝、骨生成等通路介導耐力運動對機體的生物學作用，通過綜合多平臺數據庫分析能夠有效預測相關靶蛋白富集的生物功能和通路，為進一步研究耐力運動對體內分子過程影響提供參考。