NaV1.5鈉通道C末端IQ基序的重組質粒構建及蛋白制備

張峰慧，薛迎春，許興榮，邵冬雪，張晨陽，劉巖，蘇敬陽，胡慧媛，郝麗英

（中國醫科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122）

NaV1.5是主要心肌鈉通道，高表達于心房、心室肌細胞和浦肯野纖維。NaV1.5通道由28個外顯子組成，其C末端包含243個氨基酸（1773-1940a.a.），近端部分由6個α螺旋（αⅠ～αⅥ）構成，αⅥ包含能與鈣調蛋白（calmodulin，CAM）結合的IQ基序［1-5］。IQ基序是細胞內Ca2+調節NaV1.5的關鍵元件，是耦合EFhand結構域和CAM與Ca2+相互作用的分子開關［6］。鈣離子作為細胞生長中的第二信使，參與多種生理過程，如鈣穩態調節、心臟傳導和基因表達等［7］。同時，編碼基因SCN5A突變導致NaV1.5通道結構或功能異常，引起心肌細胞動作電位除極期間通道表達水平降低，進而引發多種心血管系統疾病，如長QT綜合征（long QT syndrome，LQTS）、Brugada綜合征和心房顫動等。有研究［8］顯示，LQTS已被證明與IQ基序中Ser1904leu突變干擾通道失活并促進通道重新開放有關，Ala1924Thr突變導致BrS，但具體機制尚未闡明。本研究制備了NaV1.5鈉通道C末端IQ基序的重組蛋白，為進一步探討NaV1.5鈉通道的分子調控機制及相關心血管疾病的研究提供了重要的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-3/IQ重組質粒、TOP10穿刺菌、BL21化學感受態細菌委托武漢金開瑞生物工程有限公司合成；AxyPrep質粒DNA抽提試劑盒購自江蘇康寧生命科學（吳江）有限公司；限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自美國New England Biolabs公司；胰蛋白胨、酵母提取物均購自英國Oxoid公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐西林、溶菌酶、N-lauroylsarcosine、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）購自美國Sigma公司；Precission Protease、Glutathione-Sepharos 4B 購自美國GE Healthcare公司；其他試劑均購自中國Biosharp公司。

1.2 重組質粒的提取

將武漢金開瑞生物工程有限公司提供的表達有pGEX-6P-3/IQ重組質粒的TOP10菌種（20 μL）置于20 mL含0.14 mmol/L氨芐西林的LB液體培養基中，37 ℃、120 r/min搖床振搖培養12 h。當其吸光度值（λ=600）在0.8～0.9時，于12 000g離心1 min，收集菌液。按照AxyPrep質粒DNA小量抽提試劑盒說明書抽提質粒，測定質粒DNA濃度。

1.3 重組質粒的鑒定

1.3.1 酶切鑒定：重組質粒有BamHⅠ和XhoⅠ2個限制性酶切位點，故采用雙酶切法處理純化后的重組質粒DNA。根據限制酶使用說明書，取4 μg質粒DNA加入到50 μL酶切體系中，單酶切組加入4 μL的BamHⅠ限制酶，雙酶切組分別加入4 μL的BamHⅠ和XhoⅠ限制酶，用滅菌ddH2O補足體積。單酶切條件為37 ℃，10 min，雙酶切條件為初始37 ℃，10 min，后65 ℃，20 min。酶切處理后的質粒DNA樣品進行瓊脂糖電泳鑒定。

1.3.2 測序鑒定：取4 μg經上述方法提取的質粒DNA送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，測序結果經PubMed網站的BLAST軟件比對同源性。

1.4 IQ基序與CSL蛋白結合的預測

利用I-TASSER同源建模服務器對NaV1.5鈉通道C末端IQ基序和鈣蛋白酶抑素N末端結構域（CSL蛋白）進行同源建模，加州大學蛋白質結構在線檢測服務器對建模結果進行評估，利用分子模擬及藥物設計綜合軟件（molecular operating environment，MOE）軟件對IQ基序和CSL蛋白進行去氧加氫等預處理，使用DOCK分子對接程序模擬IQ基序與CSL蛋白結合，對結合模型進行評分。

1.5 重組蛋白的表達

根據課題組前期對CaV1.2不同蛋白片段提取方法的總結，本研究采用超聲破碎法提取IQ蛋白［9］。取60 μL轉化有IQ基序重組質粒并擴增后的BL21菌液，加入到400 mL含有氨芐西林的LB液體培養基中，37 ℃、85 r/min振搖培養12～16 h，待測定菌液吸光度至0.6～1.0時，加入400 μL 的1 mmol/L IPTG于37℃、120 r/min搖床振搖4 h，誘導重組蛋白表達。離心收集細菌，加入200 μL 1 mol/L溶菌酶、200 μL 1 mol/L DTT、2 mL 15% N-lauroylsarcosine，冰上處理30 min，超聲粉碎細菌，加入667 μL 30% TritonX-100，冰上處理30 min，收集上清，分裝備用。

1.6 重組蛋白的純化、鑒定與活性檢測

將蛋白上清液與GS-4B beads 于旋轉培養儀4 ℃孵育過夜，800 r/min離心3 min 后棄上清，Tris Buffer洗滌3次后，收集蛋白。用上述同樣方法提取純化CSL蛋白［15］，CSL蛋白與GS-4B beads孵育后用5 μL Precission蛋白酶切去GST標簽。用Bradford試劑盒測定蛋白濃度。

采用pull down方法檢測GST-IQ蛋白與CSL蛋白的結合活性。取40 μL連接有GST-IQ蛋白GS-4B beads置于2 mL EP管中，分別加入3 μL 1 mmol/L的CaCl2（Ca2+終濃度為10 μmol/L）溶液和不同濃度的CSL蛋白，使其終濃度分別為0、0.1、0.3、1、3、5、10、30 mmol/L，用Tris Buffer（pH 8.0）補充至總體系300 μL，旋轉培養儀4 ℃孵育4 h。將經15% SDA-PAFE電泳分離后的蛋白凝膠進行考馬斯亮藍染色，脫色后掃描凝膠圖片。

1.7 統計學分析

采用CS Analyzer軟件對電泳條帶進行灰度值數字化，Prism軟件進行統計分析。采用t檢驗進行差異比較，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NaV1.5鈉通道IQ基序重組質粒的酶切鑒定

將預先設計好的人源IQ基序（135 bp）于 pGEX-6P-3質粒載體（4 983 bp）的BamHⅠ/XhoⅠ處插入，其中，BamHⅠ酶切位點位于質粒載體的945 bp處，XhoⅠ酶切位點位于質粒載體的968 bp處，故重組質粒全長5 095 bp，經BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后產生2個基因片段，分別是IQ基序片段135 bp和載體片段4 960 bp。瓊脂糖凝膠電泳的3條泳道內分別為完整的IQ重組質粒，經BamHⅠ單酶切和經BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后的質粒片段，結果顯示，雙酶切組4 960 bp和135 bp處出現明顯條帶，其分子量與計算所得理論值相符，見圖1。

圖1 重組IQ質粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Validation of recombinant IQ plasmid construction by agarose gel electrophoresis of restriction enzyme digests

2.2 重組質粒測序結果（圖2）

圖2 重組質粒測序結果Fig.2 Verification of recombinant plasmid by DNA sequencing

經PubMed網站的BLAST程序比對，重組質粒與人類基因同源性為100 %，插入方向正確，讀碼方向正確，無移碼突變，進一步證明本研究重組質粒構建成功。

2.3 分子對接結果分析

采用MOE分子對接程序模擬IQ基序與CSL蛋白結合，結果顯示，2種蛋白分子對接評分為47.67，E值為12.63 Kcal/mol。IQ基序與CSL蛋白有2個結合位點，分別是IQ基序的Arg1910與CSL蛋白模型的Glu14結合、IQ基序的Arg1913與CSL蛋白模型的His13結合。Arg1910、Arg1913與CSL蛋白之間的非鍵作用力是氫鍵，結合能分別是-1.0、-1.0 kcal/mol。由此可見，CSL蛋白可以與NaV1.5鈉通道C末端IQ基序結合，見表1。

表1 IQ基序與CSL蛋白的分子對接結果Tab.1 Results of docking of CSL with the IQ motif

2.4 GST-IQ融合蛋白純度和活性鑒定

經SMS在線DNA和蛋白序列處理工具預測得的GST-IQ融合蛋白的表觀分子量為30 000。以GST蛋白作為對照，GST-IQ融合蛋白在30 000左右處可見特異性條帶，且雜帶較少，表明提取純化后獲得純度較高的IQ蛋白，與預期結果一致，見圖3。

圖3 純化后IQ蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of purified IQ protein

為了考察經超聲破碎法提取的GST-IQ蛋白的生物學活性，并驗證MOE預測結果，將純化后的GST-IQ蛋白與不同濃度的CSL蛋白在1 mmol/L Ca2+條件下共同孵育，經pull down實驗檢測發現，GST-IQ蛋白能夠與CSL蛋白結合，且隨著CSL蛋白濃度的增加，兩者的結合量也呈遞增趨勢（圖4），提示經本研究方法提取純化的GST-IQ蛋白具有較好的生物學活性，適合后續NaV1.5鈉通道的相關研究中。

圖4 IQ蛋白和CSL蛋白的pull down分析結果Fig.4 Pull down assay to assess binding of IQ protein to CSL protein

3 討論

在哺乳動物中，電壓門控鈉通道可以快速開放和關閉，產生的動作電位在快速電信號傳導中起重要作用［10］。有研究［4］表明，存在于心肌細胞的蛋白可作用于NaV1.5的不同結構域而參與NaV1.5的生物合成、運輸、活性調節，如CAM等。其中，CAM可以在無Ca2+（apo）或Ca2+飽和條件下與NaV1.5的IQ基序結合，使鈉通道緩慢失活曲線右移，進而引起動作電位時程延長［11］。

IQ基序廣泛分布于肌球蛋白和非肌球蛋白中，包括神經元生長蛋白、電壓門控通道、磷酸酶等，其生物功能廣泛，如參與神經元生長、有絲分裂、電壓門控通道的信號傳導等［12］。而位于心肌NaV1.5鈉通道C末端的IQ基序，不僅參與許多蛋白的Ca2+依賴性調節，還可能包含一些心臟疾病的突變位點。已知IQ基序在所有鈉通道亞型中是高度保守的，而在CaV1.2中，C末端的IQ基序R1902C突變與家族性自閉癥有關，這種突變被證明可以誘導Ca2+穩態失活時的左移，同時影響IQ基序的構象。NaV1.5是一些遺傳性心律失常相關疾病的突變位點，在IQ基序中已經發現了與LQTS3有關的4個突變位點，分別是E1901Q、S1904L、Q1909R和R1913H［13］。

IQ基序具有廣泛的生理功能，但目前對于IQ基序與各種心臟疾病致病機制之間關系的研究尚不完善。本研究成功構建了IQ基序的重組質粒，該質粒能夠在大腸桿菌BL21中表達高濃度蛋白，經GS-4B beads純化后，具有較好的純度和生物學活性。IQ基序是CaM發揮鈣依賴性失活和鈣依賴性激活功能的主要結合區域，而CSL同CaM競爭結合于CaV1.2的C末端的IQ區域，進而達到調控通道活性的目的?；贗Q基序在CaV和NaV通道亞型中高度保守，通過成功構建NaV1.5鈉通道的GST-IQ重組蛋白，并經pull down 實驗檢測純化后的GST-IQ蛋白是否具有生物學活性，同時檢測該結合作用的CSL蛋白濃度依賴性，結果表明，本研究成功制備出具有生物學活性的重組IQ蛋白，為心肌NaV1.5鈉通道的相關調節機制奠定了分子基礎，也為后續鈉離子通道病的研究和相關藥物研發提供了新方向。