線粒體受體轉(zhuǎn)位蛋白靶向光動力學(xué)治療對結(jié)腸癌的作用

肖日姣，廖照輝，韓赫，魏房，李震

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院第四普通外科，沈陽 110032）

光動力學(xué)治療（photodynamic therapy，PDT）是一種經(jīng)臨床批準(zhǔn)且高度可控的微創(chuàng)治療方法，已成為傳統(tǒng)癌癥治療（如化療和手術(shù)）的一種替代或補(bǔ)充方法［1-3］。PDT需要光敏劑、光輻照和氧這3個(gè)要素。在氧氣存在的條件下，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的光敏劑通過特定波長光的輻照被激活，產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS），如單線態(tài)氧和自由基，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。PDT的療效在很大程度上取決于光敏劑的腫瘤細(xì)胞選擇性和亞細(xì)胞定位［1-2］。線粒體在為細(xì)胞提供能量和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，故其作為PDT靶標(biāo)的前景尤為廣闊。線粒體受體轉(zhuǎn)位蛋白（mitochondrial receptor 18 kDA translocation protein，TSPO）是位于線粒體外膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在正常組織和器官有不同程度的表達(dá)，但在乳腺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中，其表達(dá)水平均有顯著升高，且較高的TSPO表達(dá)水平與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。此外，TSPO還與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、類固醇生成、細(xì)胞增殖、卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)和凋亡等許多細(xì)胞過程有關(guān)。TSPO靶向治療可能延長線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的開放時(shí)間，導(dǎo)致凋亡因子由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，觸發(fā)線粒體凋亡級聯(lián)反應(yīng)。高水平ROS可有效地破壞MPTP，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、死亡。因此，TSPO有望成為提高腫瘤治療效果的靶點(diǎn)［2-4］。TSPO靶向光敏劑IR700DX-6T接受690 nm光輻照后可產(chǎn)生ROS，可使低功率光照射獲得高效的PDT結(jié)果，從而避免潛在的非腫瘤組織光毒性損傷［2-3，5］。

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤，已成為全球腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因［6］。當(dāng)前主要的治療策略包括手術(shù)、化療和放療，然而通常因腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而生存率較低。本研究擬利用IR700DX-6T驗(yàn)證離體及在體結(jié)腸癌細(xì)胞對于PDT的敏感性，評估IR700DX-6T相對于傳統(tǒng)光敏劑的優(yōu)勢，以期為結(jié)腸癌PDT的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌細(xì)胞系，包括MC38、LS174T、SNU-C4、SNU-503、HCT116、HT-29、DLD-1、RKO、SW620和SW480，均來自American Type Culture Collection（ATCC），KM12-SM、KM12-C、SC和CC來自美國范德堡大學(xué)Coffey實(shí)驗(yàn)室；氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸鈉（azoxymethane/dextran sulfate sodium，AOM/DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸癌小鼠模型獲贈自美國范德堡大學(xué)Coffey實(shí)驗(yàn)室；RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基、小牛血清購自美國Gibro公司；TSPO抗體、兔抗TSPO一抗、山羊抗兔二抗、蛋白酶抑制劑購自美國Abcam公司；抗體稀釋液購自美國Cell Signaling公司；兔抗β-actin一抗、RIPA緩沖液、抗體稀釋液購自美國Sigma公司；BCA蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；CCK-8購自美國Dojindo Molecular Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、5%青霉素-鏈霉素雙抗RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞。

1.2.2 免疫組化：將小鼠結(jié)腸癌及癌旁組織于10%甲醛溶液中固定后石蠟包埋。切片后于60 ℃烤片1 h，脫蠟及復(fù)水等步驟均在Leica Bond Max IHC免疫組化染色機(jī)上進(jìn)行。脫蠟后用抗原表位提取液熱誘導(dǎo)抗原還原20 min。載玻片與抗TSPO抗體在信號素抗體稀釋液（1 ∶ 1 000）中孵育1 h后，與山羊抗兔二抗在抗體稀釋液（1 ∶50）中孵育15 min。采用Bond Polymer Refine檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)可視化。

1.2.3 Western blotting：將小鼠結(jié)腸癌及癌旁組織在液氮中研磨成粉末，用RIPA緩沖液和1/100蛋白酶抑制劑混合物從組織或培養(yǎng)的細(xì)胞中提取蛋白。采用BCA蛋白分析試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣品取20 μg總蛋白上樣，行12% SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，4 ℃阻滯過夜。用TBST洗膜3次后加入兔抗TSPO一抗孵育12 h；TBST洗膜3次，加入兔抗β-actin一抗，于4 ℃孵育12 h，TBST沖洗3次；加入IR Dye 800CW驢抗兔二抗，室溫孵育1 h。TBST沖洗3次，在Odyssey CLx成像系統(tǒng)下掃描蛋白條帶。

1.2.4 PDT體外實(shí)驗(yàn)：接種細(xì)胞至96孔板并培養(yǎng)過夜。棄培養(yǎng)基，更換為含不同濃度IR700DX-6T的新鮮培養(yǎng)基。孵育細(xì)胞16 h，新鮮培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞后，用LED光（波長670～710 nm，峰值690 nm，輻照功率30 mW/cm2）照射細(xì)胞行PDT治療。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞16 h，使用CCK-8試劑盒測量細(xì)胞活力。

1.2.5 皮下種植結(jié)腸癌小鼠模型建立與PDT體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：動物研究獲得范德比爾特機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會（IACUC）的批準(zhǔn)。6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購自美國范德堡大學(xué)Jackson實(shí)驗(yàn)室。將結(jié)腸癌MC38細(xì)胞（5×106）皮下注射于每只小鼠側(cè)翼兩側(cè)。細(xì)胞注射后7 d，注射部位皮下產(chǎn)生體積＞8 mm3腫瘤且無局部皮膚破潰及感染癥狀小鼠視為成功荷瘤小鼠。將荷瘤小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組4只。向荷瘤小鼠尾靜脈注射含10 nmol/L IR700DX-6T的100 μL PBS（實(shí)驗(yàn)組）或不含IR700DX-6T的100 μL PBS（對照組）。注射后2 h用LED光照射左側(cè)腫瘤，LED燈置于腫瘤上方約1.5 cm處區(qū)域，輻照功率為30 mW/cm2，持續(xù)10 min。將經(jīng)PDT治療的左側(cè)腫瘤視為原發(fā)腫瘤，未經(jīng)治療的右側(cè)腫瘤視為遠(yuǎn)端腫瘤。每天用卡尺測量小鼠雙側(cè)腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積=腫瘤長度（mm）×腫瘤寬度2（mm2）/2，持續(xù)測量14 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSPO在結(jié)腸癌細(xì)胞系及癌組織中的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，13株人類結(jié)腸癌細(xì)胞株和1株小鼠AOM誘導(dǎo)的結(jié)腸腺癌細(xì)胞株MC38中，TSPO表達(dá)水平均明顯高于正常結(jié)腸黏膜上皮（圖1A）。選取3只AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸腫瘤組織、癌旁正常黏膜及MC38細(xì)胞皮下移植腫瘤組織，結(jié)果顯示，腫瘤組織中TSPO表達(dá)水平均高于匹配的鄰近正常結(jié)腸黏膜組織（圖1B）。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果同樣證實(shí)了腫瘤組織中TSPO的表達(dá)高于其周圍正常結(jié)腸黏膜組織（圖1C）。

圖1 TSPO在結(jié)腸癌細(xì)胞系及小鼠結(jié)腸癌組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of TSPO in colon cancer cell lines and mouse colon cancer tissues

2.2 TSPO-PDT抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖

結(jié)果顯示，TSPO-PDT可抑制鼠源性結(jié)腸癌細(xì)胞株MC38增殖（P＜ 0.01），并具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性（圖2A）；同時(shí)，對9種人類結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T、SNU-C4、SNU-503、HCT116、HT-29、DLD-1、RKO、SW620和SW480的增殖均有抑制作用（P＜0.01），并具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性（圖2B）。表明PDT聯(lián)合IR700DX-6T對TSPO（+）結(jié)腸癌細(xì)胞株均有抑制增殖作用。

圖2 PDT對不同結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用Fig.2 Effects of PDT on different colon cancer cell lines

2.3 TSPO-PDT抑制皮下種植結(jié)腸癌小鼠模型腫瘤生長

對免疫活性C57BL/6J小鼠側(cè)翼兩側(cè)皮下注射MC38細(xì)胞，建立皮下種植結(jié)腸癌小鼠模型。TSPOPDT只應(yīng)用于每只小鼠左側(cè)的腫瘤（原發(fā)腫瘤），右側(cè)腫瘤被認(rèn)定為遠(yuǎn)端腫瘤。結(jié)果（圖3）顯示，對照組小鼠雙側(cè)腫瘤生長速度無明顯差異，而實(shí)驗(yàn)組小鼠的原發(fā)腫瘤生長速度明顯低于遠(yuǎn)端腫瘤（P＜0.01），但無論是原發(fā)腫瘤或遠(yuǎn)端腫瘤，其生長速度均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。

圖3 PDT對皮下種植結(jié)腸癌小鼠模型的作用Fig.3 Effects of PDT on the mouse model of colon cancer implanted subcutaneously

3 討論

近年來，PDT的臨床應(yīng)用日益受到廣泛重視。EICKHOFF等［7］應(yīng)用5-氨基酮戊酸為光敏劑對長達(dá)10 cm的上段食管癌進(jìn)行PDT 3個(gè)療程后，利用內(nèi)鏡直視和超聲內(nèi)鏡檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)完全消退，且組織活檢也證實(shí)腫瘤已經(jīng)完全消除，隨訪23個(gè)月，未見復(fù)發(fā)征象，因此認(rèn)為早期表淺的食管鱗狀上皮細(xì)胞癌可以通過5-氨基酮戊酸PDT完全治愈，但仍需對這些患者進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪。根治性切除是胃癌的首選治療措施，療效十分肯定。近年來，有研究者對部分早期胃癌患者嘗試應(yīng)用PDT治療，目的是在治愈胃癌的同時(shí)免除手術(shù)創(chuàng)傷。NAKAMURA等［8］應(yīng)用PDT治療7例早期胃癌，均獲得成功，術(shù)后病理活檢未發(fā)現(xiàn)癌組織殘留。研究認(rèn)為，PDT對胃腸道早期小癌變、癌前病變是可行的，對于拒絕手術(shù)治療的胃腸道腫瘤患者，PDT可以用作替代治療措施之一。PRASAD等［9］采用PDT治療25例已無法手術(shù)切除的膽管癌患者，在PDT治療后放置膽管支架進(jìn)行膽道減壓，患者的總平均生存期為344 d，其中PDT治療后生存期為214 d，1年生存率為30%。多因素分析表明，影像學(xué)檢查結(jié)果顯示存在明顯腫塊，確診膽管癌，開始PDT的時(shí)間間隔越長，愈后就越差。

PDT也存在一定的不足和局限性，其中，對非腫瘤組織產(chǎn)生的光毒性最為突出［1，10-13］；其次，由于可見光在組織中穿透性的限制，對位于體內(nèi)深部腫瘤的作用很微弱；另外，光敏劑攝取和腫瘤內(nèi)氧化存在不均一性等［4，10，14-16］。前期研究［2-3，5］證實(shí)，以TSPO為靶向的光敏劑IR700DX-6T可以較高濃度富集于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而腫瘤周圍正常細(xì)胞中則濃度較低。本研究證實(shí)TSPO在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯高于正常組織。因此，相對于普通PDT，TSPO-PDT可以明顯降低其對非腫瘤組織產(chǎn)生的光毒性。

本研究還證實(shí)，盡管實(shí)驗(yàn)組荷瘤小鼠未經(jīng)TSPO-PDT的遠(yuǎn)端腫瘤生長速度大于原發(fā)腫瘤，但與對照組相比，其生長速度仍明顯降低。IM等［17］認(rèn)為，PDT對遠(yuǎn)端腫瘤的抑制作用可能是因其可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫原性碎片并招募樹突狀細(xì)胞聚集于腫瘤部位，增強(qiáng)了抗原呈遞，并推測PDT可能是一種有前途的基于樹突狀細(xì)胞的免疫治療方案。

綜上所述，本研究利用前期合成的TSPO靶向光敏劑IR700DX-6T，驗(yàn)證了離體及在體結(jié)腸癌細(xì)胞對于PDT均具有較高敏感性，IR700DX-6T相對于傳統(tǒng)光敏劑具有明顯優(yōu)勢。因此，PDT有可能成為一種新的結(jié)腸癌臨床治療措施。